實(shí)驗(yàn)材料:植物葉片

1.實(shí)驗(yàn)步驟
一、 取材料（約1g ，根據(jù)具體情況而定），放入冰鎮(zhèn)的培養(yǎng)皿里，加入解離液（約1～2mL），用鋒利分刀片一次性快速切碎，整個(gè)過(guò)程，材料必須浸沒(méi)在解離液里。
二、 吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的解離液，用400目的濾布過(guò)濾到冰鎮(zhèn)的離心管中，放置4℃的冰箱中孵育10分鐘。
三、 離心。轉(zhuǎn)速：1000轉(zhuǎn)/分，溫度：4℃，時(shí)間：8分鐘。
四、去上清，使用BD cycletest plus DNA reagent kit中的B液作用10min，C液染色10min。
五、上機(jī)檢測(cè)。

1.解離液：
  Chopping Buffer（LB01）
   成分 濃度 用量
   Tris 15mM 363mg
   Na2EDTA 2mM 148.9mg
   精胺 0.5mM 20.2mg
   KCl 80mM 1.193g
   NaCl 20mM 233.8mg
   Triton X-100 0.1% 200ul
   二巰基乙醇 15mM 220ul  
   加去離子水 至200ml
   PH7.5，0.22um濾膜過(guò)濾，-20?C凍存。

結(jié)果：
   1.樣本：桉樹(shù)幼苗的幼嫩葉片（正常體細(xì)胞）
   染液：BD cycletest plus DNA reagent kit
        
                File analyzed: Data.002.fcs
                Date analyzed: 31-Mar-2011
                Model: 1DA0n_DSD
                Analysis type: Automatic analysis

                Ploidy Mode: First cycle is diploid

                Diploid: 100.00 %
                Dip G1: 71.49 % at 63.58
                Dip G2: 11.61 % at 127.15
                Dip S: 16.90 %   G2/G1: 2.00
                %CV: 5.23

                Total S-Phase: 16.90 %
                Total B.A.D.: 19.34 %  

                Debris: 42.60 %
                Aggregates: 2.76 %
                Modeled events: 6646
                All cycle events: 3631
                Cycle events per channel: 56
                RCS: 2.674

2.樣本：蝴蝶蘭葉片（嵌合體）
   染液：BD cycletest plus DNA reagent kit
                                                               
分析與總結(jié)：
1. 實(shí)驗(yàn)材料的選擇：以選取植物葉片為實(shí)驗(yàn)材料*。若實(shí)驗(yàn)材料取自野外，為避免運(yùn)輸過(guò)程中材料受到高溫的影響，采摘后應(yīng)立即用濕濾紙包裹置于冰盒中。若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可將材料儲(chǔ)存于-70℃冰箱中保存數(shù)日。
2. 細(xì)胞核的獲取數(shù)量：建議獲取20,000—30,000個(gè)，因?yàn)橛胢odfit分析時(shí)，擬合的細(xì)胞數(shù)至少是10,000個(gè)，分析結(jié)果*，而植物葉片制備細(xì)胞核懸浮液時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的碎片，會(huì)顯著降低擬合細(xì)胞的比例，故需提高獲取數(shù)量。
3. 獲取模板的優(yōu)化：FSC Vs SSC 選取log放大，以FL2為閾值，有利于排除部分碎片，同時(shí)較小的細(xì)胞核也不會(huì)漏檢，另外，再設(shè)置一個(gè)FL2 Vs SSC點(diǎn)圖，有利于排除一些帶有色素的細(xì)胞器的干擾。

1.研究背景
1.1原生質(zhì)體的概念
    植物原生質(zhì)體是指去除細(xì)胞壁被質(zhì)膜所包圍的、具有活力的細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)(包括各種細(xì)胞器、細(xì)胞骨架系統(tǒng)及胞基質(zhì))和細(xì)胞核等部分。原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生技術(shù)具有使用范圍廣、可行性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是植物生物工程的基礎(chǔ)。對(duì)植物原生質(zhì)體的研究，可追溯到20世紀(jì)60年代，英國(guó)植物學(xué)家Cocking用酶解方法降解細(xì)胞壁，獲得了番茄根尖原生質(zhì)體，自此原生質(zhì)體的研究得到迅速發(fā)展。近年來(lái)，由于原生質(zhì)體具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、發(fā)育同步性好、群體數(shù)量大、DNA分子易于進(jìn)入細(xì)胞，易獲得純合性轉(zhuǎn)化子的特點(diǎn)，及其培養(yǎng)技術(shù)與有關(guān)的細(xì)胞、分子和遺傳等學(xué)科的交叉滲透，使植物原生質(zhì)體的研究越來(lái)越受到重視。研究領(lǐng)域也從分離原生質(zhì)體進(jìn)行的生理生化和利用不同材料的原生質(zhì)體得到再生植株的階段轉(zhuǎn)到原生質(zhì)體的應(yīng)用(尤其是遺傳性狀改良)方面。

1.2原生質(zhì)體的制備
     原生質(zhì)體的分離方法有兩種：機(jī)械分離法和酶解分離法。機(jī)械分離法由于產(chǎn)量低、方法繁瑣費(fèi)力；以及對(duì)分生組織和液泡化程度不高的細(xì)胞不適用的特點(diǎn)，現(xiàn)在已很少有人使用。                        酶解分離法為目前普遍采用的原生質(zhì)體分離方法。酶解是在25~28 ℃的恒溫、黑暗或弱光下進(jìn)行；酶解后經(jīng)過(guò)0.038 mm孔徑左右的鎳絲網(wǎng)過(guò)濾，濾去消解不*的組織碎塊（導(dǎo)管、篩管等）和細(xì)胞團(tuán)。然后將濾液離心，棄去上清液，將離心下來(lái)的原生質(zhì)體重新懸浮在洗液(CPW)中，再次離心，去上清液，重復(fù)3 次。在倒置顯微鏡下檢查純化效果，效果好，用原生質(zhì)體培養(yǎng)基離心，效果不好，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的蔗糖離心，使完整的原生質(zhì)體浮于液面。             

1.3原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化
     1）生物介質(zhì)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。目前應(yīng)用的生物介質(zhì)主要是根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。它們轉(zhuǎn)化的原理分別是通過(guò)活化Ti 和Ri 質(zhì)粒的Vir 區(qū)基因，達(dá)到對(duì)T-DNA 轉(zhuǎn)移的目的。2）細(xì)胞融合法。PEG介導(dǎo)法由Davey 等首先建立，主要原理是借助細(xì)胞融合劑誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA。PEG法的融合率可達(dá)10%~15%，無(wú)種屬特異性，幾乎可誘導(dǎo)任何原生質(zhì)體的融合。細(xì)胞電融合法利用細(xì)胞在相對(duì)電極之間的介電電泳，誘導(dǎo)細(xì)胞按特定方向排列，通過(guò)電極間產(chǎn)生的較高場(chǎng)強(qiáng)的電脈沖使相互接觸的細(xì)胞發(fā)生電穿孔，進(jìn)而發(fā)生電融合。3）激光微束穿刺法。激光微束穿刺法就是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起細(xì)胞膜可逆性穿孔，從而使處于細(xì)胞周圍的外源DNA 隨之進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因方法。激光微束穿刺法操作簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞的損傷小，可以準(zhǔn)確定位于被照射的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。4）電擊法是利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電擊穿孔”，形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的攝入。                            

1.4原生質(zhì)體的應(yīng)用
    由于原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁這一屏障，因而使其具有特殊的優(yōu)點(diǎn)。原生質(zhì)體不僅可作為一個(gè)單細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)研究細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂與分化、攝入細(xì)胞器、病毒侵染機(jī)理、膜透性及離子轉(zhuǎn)運(yùn)等基礎(chǔ)理論研究的理想材料；同時(shí)還是原生質(zhì)體培養(yǎng)和原生質(zhì)體融合的基礎(chǔ)。而且，近年來(lái)以原生質(zhì)體為材料利用膜片鉗技術(shù)研究離子通道及原生質(zhì)體在受光、脅迫和激素作用后的調(diào)節(jié)機(jī)制已成為研究的熱點(diǎn)。此外，原生質(zhì)體也被用來(lái)作為研究植物細(xì)胞鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)節(jié)機(jī)制的理想材料。

2.實(shí)驗(yàn)用品
   熒光顯微鏡：觀察轉(zhuǎn)基因效率，觀察流式分選效率。 
   低速離心機(jī)和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：收集細(xì)胞及原生質(zhì)體
   流式細(xì)胞儀（BD FACSAriaIII）：分選原生質(zhì)體
  細(xì)胞培養(yǎng)箱：細(xì)胞培養(yǎng)

   試劑和緩沖液：
   Protoplast enzyme solution (pH 5.6)
   1% cellulase      
   0.25% macerozyme  
   0.4 M Mannitol (0.5M for Tobacco)
   8 mM CaCl2
   5 mM Mes-KOH  
   BSA 0.1%

   W5 solution ( pH 5.6)
   154 mM NaCl
   125 mM CaCl2
   5 mM KCl
   5 mM Glucose
   1.5 mM Mes-KOH

   MaMg solution (pH 5.6)
   400 mM Mannitol
   15 mM MgCl2
   5 mM Mes-KOH

   PEG solution (can be stored for up to 1 week)
   400 mM Mannitol
   100 mM Ca(NO3)2
   40% PEG (Mw=8000)

   21% sucrose, 1 M Mannitol, 1 M Ca(NO3)2

3.實(shí)驗(yàn)方法
3.1 分離原生質(zhì)體
   前一天晚上
   1. 使用約15 mL protoplast enzyme solution消化細(xì)胞壁。
   A. 選用生長(zhǎng)1-3 周的植株 (請(qǐng)根據(jù)需要自行優(yōu)化條件) 。
   B. 23oC，孵育7-12小時(shí)，溫和震蕩混勻。 
   *天，上午
   2. 用100 ?m濾網(wǎng)過(guò)濾收集細(xì)胞至標(biāo)記好的培養(yǎng)皿中。
   3. 在50 ml 管中加入等體積的21% 蔗糖溶液。
   4. 將第二步的細(xì)胞溶液加入第三步的蔗糖溶液中。
   5. 梯度離心10 min，750 rmp。
   6. 用藍(lán)槍頭從上層中吸取健康的完整的細(xì)胞。
   7. 用等體積的W5溶液重懸細(xì)胞。
   8. 離心，500 rmp，5min。
   9. 用W5溶液重懸細(xì)胞沉淀。
   10. 將細(xì)胞置于4 oC 保存直至使用。

3.2 PEG-介導(dǎo)轉(zhuǎn)化
    *天，下午
    1. 準(zhǔn)備用于PEG轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體
    A. 預(yù)冷新鮮制備的PEG溶液。
    B. 500 rpm，1 min，離心原生質(zhì)體。
    C. 用MaMg 溶液重懸細(xì)胞至合適濃度: 106數(shù)量級(jí), 至少300 ?l體積。
    D. 加DNA至一個(gè)新的14ml圓底管中– 所加DNA的量取決于表達(dá)水平。
    E. 加300 ?l 細(xì)胞溶液至管中，溫和混勻。
    2. PEG轉(zhuǎn)化
    A. 用等體積的PEG(300 ?l + DNA volume)和原生質(zhì)體 & DNA溶液(step E)混勻，注意要非常溫和。
    B. 室溫孵育30 min。
    3. 用W5溶液逐漸稀釋去除PEG
    A. 700 ?l, 5 min -用剪掉末端的槍頭上下溫和吹打。
    B. 1 ml, 3 min; 2 ml – 每一步溫和的轉(zhuǎn)動(dòng)管子。
    C. 離心，500 rpm，5min，棄上清。
    4. 用1 ml W5 溶液重懸細(xì)胞沉淀。 
    5. (可選) 從未轉(zhuǎn)化的對(duì)照組中分離蛋白進(jìn)行Western檢測(cè)。
    6. 將細(xì)胞置23oC孵育 1-3 天。

3.3 流式分選Protoplast
   1. 對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整原生質(zhì)體濃度為5*10^6/mL。
   2. 使用BD FACSAriaIII流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，收集GFP+原生質(zhì)體。
      A.打開(kāi)準(zhǔn)備好的流式細(xì)胞分選儀，本實(shí)驗(yàn)使用的是BD FACSAriaIII。
     B.儀器設(shè)置為：100µm噴嘴，20 psi鞘液壓力。
      C.細(xì)胞密度和樣本上樣速度可以根據(jù)特定需要加以調(diào)整——要高得率還是高速度。
      D.使用樣本混勻功能，防止在分選過(guò)程中原生質(zhì)體發(fā)生沉降。
      E.畫(huà)一張F(tuán)SC/SSC散點(diǎn)圖，調(diào)節(jié)電壓使細(xì)胞群體出現(xiàn)在散點(diǎn)圖的*。
      F.再畫(huà)一張GFP/PE-Texas Red散點(diǎn)圖，調(diào)節(jié)電壓，使野生型對(duì)照原生質(zhì)體群體(non-GFP)   
        出現(xiàn)在散點(diǎn)圖的*，GFP陽(yáng)性原生質(zhì)體群體會(huì)在GFP熒光通道信號(hào)更強(qiáng)的位置現(xiàn)（在野生型對(duì)照樣本中沒(méi)有這個(gè)群體）。
      G.如有必要，調(diào)節(jié)補(bǔ)償，使GFP陰性和陽(yáng)性原生質(zhì)體群體分得更開(kāi)。
      H.設(shè)置門，圈住GFP陽(yáng)性群體。需要準(zhǔn)備一個(gè)non-GFP原生質(zhì)體陰性對(duì)照（Figure 1.）用以確定門的界限。
      I.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要以及目的細(xì)胞的百分比，選擇合適的分選模式——高得率或者高純度。
      注：初始條件可選取100µm噴嘴，20 psi鞘液壓力。后期根據(jù)樣本狀態(tài)的不同，可以進(jìn)一步優(yōu)化分選條件，包括：選擇更大的噴嘴尺寸，更低的鞘液壓力，用戶自定義分選模式，優(yōu)化原生質(zhì)體培養(yǎng)緩沖液，使用原生質(zhì)體培養(yǎng)緩沖液替代鞘液，直接分選原生質(zhì)體到培養(yǎng)皿中等，都有助于保護(hù)分選后原生質(zhì)體的活性。
      3. 對(duì)分選后得到的GFP+原生質(zhì)體進(jìn)行離心，棄上清。
      4. 分選原生質(zhì)體后續(xù)實(shí)驗(yàn)，分析原生質(zhì)體基因組DNA，蛋白或代謝產(chǎn)物表達(dá)水平。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
                               
                               Figure 1. Negative Control

                               
                               Figure 2. GFP Positive Protoplast