液相色譜儀是屬于易學(xué)難用的儀器，特別講究“正確使用"和經(jīng)驗(yàn)。液相工作者接觸多的是流動(dòng)相，流動(dòng)相也是造成液相色譜各種問(wèn)題的主要源頭。液相色最常見(jiàn)的故障一是堵，二是漏。下面就這兩分別展開(kāi)討論（流動(dòng)相以甲醇為例，色譜柱以C18為例） 。

一·為何會(huì)堵

“堵"的表現(xiàn)現(xiàn)象就是柱壓異常升高，直接原因就是流路不暢。堵塞的主要位置就是在色譜柱的前端，主要原因就是流動(dòng)相里有雜質(zhì)，雜質(zhì)的主要來(lái)源就是細(xì)菌。
   首先我們要認(rèn)識(shí)到，一般的國(guó)產(chǎn)甲醇其實(shí)不需要額外過(guò)濾處理，直接使用沒(méi)有問(wèn)題。即使是有些固態(tài)微粒雜質(zhì)，也能在液相流路系統(tǒng)前端的過(guò)濾頭上排除，真正容易引起問(wèn)題的，是水中的細(xì)菌。新制備的純水在室內(nèi)放置幾天就會(huì)長(zhǎng)菌，而這些細(xì)菌雖然肉眼不可見(jiàn)，卻足以堵塞柱填料顆粒的空隙，造成柱子很快報(bào)廢。這就是在配制流動(dòng)相時(shí)造成的細(xì)菌污染的原因，解決它的方法很簡(jiǎn)單，就是確保水的可靠性。

有兩種方式推薦：

（1）理想的方式當(dāng)然是購(gòu)買(mǎi)實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用純水機(jī)，既方便又可靠，質(zhì)量也放心。缺點(diǎn)就是價(jià)格不菲。

（2）成箱購(gòu)買(mǎi)市售品牌純凈水，如500ml一支的怡寶或娃哈哈，這些水的質(zhì)量足以應(yīng)付液相色譜的要求。先隨機(jī)抽取一支做一下細(xì)菌平板實(shí)驗(yàn)，待菌落數(shù)合格方可使用。這樣每次只要單獨(dú)開(kāi)一支即可，也很方便。每次成本2元左右。這里特別指出一個(gè)細(xì)節(jié)：在絕大多數(shù)書(shū)本上，凡談到配制流動(dòng)相都會(huì)談到后一個(gè)過(guò)濾的步驟。但是從我們長(zhǎng)期使用的實(shí)際效果來(lái)說(shuō)，只要能保證水的質(zhì)量，這一步可以也應(yīng)當(dāng)去除。

水有保證 可以不過(guò)濾？

原因有以下兩點(diǎn)：

（1）流動(dòng)相過(guò)濾在理論上有好處，但是實(shí)際操作時(shí)由于不可能做到專(zhuān)瓶專(zhuān)用，反而容易造成的交叉污染，對(duì)于配比復(fù)雜的流動(dòng)相影響更大。

（2）流動(dòng)相過(guò)濾在經(jīng)濟(jì)成本上不劃算。買(mǎi)一套過(guò)濾裝置要6000多元，且過(guò)濾器是比較容易損壞的設(shè)備。主要是過(guò)濾片的成本太高，一片就要幾十元。按一般液相柱的正常使用壽命計(jì)算，過(guò)濾片的成本會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于色譜柱的成本上升。

“堵"的原因之一：純水中的細(xì)菌污染

指的是：流動(dòng)相剛開(kāi)始不長(zhǎng)菌，在使用時(shí)卻產(chǎn)生了細(xì)菌污染。這主要是在使用多元液相色譜儀時(shí)的一種不良使用習(xí)慣造成的。舉簡(jiǎn)單的例子：50%的甲醇水流動(dòng)相，有兩種使用方式。一種方式是在上機(jī)前就配好混合在一起，另一種方式是在流路A放純甲醇，流路B放純水。從單純實(shí)驗(yàn)效果來(lái)說(shuō)，后一種有明顯的優(yōu)點(diǎn)：首先是簡(jiǎn)單，不需要實(shí)驗(yàn)者另個(gè)計(jì)算配比混合，其次就是比例準(zhǔn)確，能得到保留時(shí)間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)效果。

但是，它有一個(gè)致命的缺陷，就是純水在流動(dòng)相瓶中幾天時(shí)間就會(huì)長(zhǎng)細(xì)菌（很多情況下不僅僅用純水作流動(dòng)相，而是用緩沖鹽溶液，本身就是優(yōu)質(zhì)肥料，細(xì)菌長(zhǎng)得更迅速），一旦有細(xì)菌柱子就壞得很快。所以這種方式要求操作人員每次實(shí)驗(yàn)都要用新制備的純水，更要求在每次實(shí)驗(yàn)后把水相換掉，換成甲醇沖洗干凈，這一點(diǎn)在實(shí)際工作中很多人意識(shí)不強(qiáng)，就是意識(shí)到了但多次使用中總有一兩次會(huì)遺漏，但是往往這一兩次就足以產(chǎn)生致命的影響。因?yàn)橐合嗌V柱的堵塞是不可逆的。

所以，寧可犧牲小小的保留時(shí)間的重復(fù)性，也不要用純水溶液作為流動(dòng)相的一組。從實(shí)際實(shí)驗(yàn)效果來(lái)說(shuō)，我建議用10%的甲醇水代替水溶液（以前我做過(guò)不同比例甲醇水的細(xì)菌總數(shù)實(shí)驗(yàn)，在5%就基本可以抑菌，在10%及以上就可以殺菌了），這樣可以有效排除長(zhǎng)細(xì)菌的隱患，既可作流動(dòng)相，也可沖柱。就算是在配制流動(dòng)相時(shí)會(huì)計(jì)算得麻煩一些，但是一次麻煩，終身受益。

“堵"的原因之二：使用流動(dòng)相時(shí)的細(xì)菌污染

作

常見(jiàn)問(wèn)題有以下幾種：

（1）在更換零件時(shí)選擇的型號(hào)有誤，接口不是很匹配，在擰緊的時(shí)候產(chǎn)生變形而使得管路堵塞。

（2）樣品處理液凈化得不干凈，長(zhǎng)期會(huì)在六通閥和柱之間形阻塞不暢。

（3）在使用用手動(dòng)六通閥時(shí)，有些人可能由于手勁小的原因，轉(zhuǎn)動(dòng)的不到位，于是造成流路形成死堵，壓力快速升高超過(guò)警戒值。

（4）在使用金屬管路作出廢液管時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意好廢液瓶中先放一些水，并把廢液管的出口端結(jié)晶成塊并造成堵塞。這種情況不常見(jiàn)，但卻的確發(fā)生過(guò)。

查堵的方法

在發(fā)生“堵"的現(xiàn)象后，就需要找出原因，主要是什么位置發(fā)生了“堵"。

注意，絕大多數(shù)情況下，整個(gè)系統(tǒng)只會(huì)有一個(gè)地方發(fā)生堵塞。查堵的方法是從尾向前逆向分段拆開(kāi)，仔細(xì)觀察壓力數(shù)值，如果某一個(gè)部件（柱子除外）裝上和拆下時(shí)的壓力差別很大，可發(fā)展變化判斷。至于柱的堵塞，可以通過(guò)換同樣規(guī)格的柱的壓力是否一致來(lái)判斷。

溶劑入口過(guò)濾頭

未經(jīng)過(guò)濾的溶劑或溶劑瓶中生長(zhǎng)的微生物都會(huì)降低溶劑入口過(guò)濾頭的壽命,并影響泵性能.一般3個(gè)月清洗或更換。將溶劑入口管從過(guò)濾頭和瓶蓋組件處撥下,如果管線中充滿溶劑,當(dāng)過(guò)濾頭性能良好時(shí),溶劑會(huì)自由地從管中滴出．如果堵塞，就沒(méi)有溶劑或只有很少量的溶劑從管中滴出。不要使用超聲清洗溶劑入口過(guò)濾頭，否則玻璃顆?？赡苁瞧扑樵斐啥氯?。

二·為何會(huì)泄露

過(guò)濾膜的類(lèi)型

聚四氟乙烯膜（一般用于有機(jī)相）幾乎可以和所有的溶劑、酸和堿相容。

尼龍66膜（一般用于有機(jī)相）可以和大多數(shù)溶劑、有機(jī)物和水相容，建議不要用于強(qiáng)酸、二氯甲烷和DMF。

纖維素硝酸酯(一般用于水相)主要用于過(guò)濾器,可以和多數(shù)水性和非水性溶劑相溶,但不是所有的水性和非水性溶劑。

再生纖維素膜一般用于HPLC生物樣品和有機(jī)溶劑的制備和過(guò)濾,是通用型HPLC過(guò)濾器,具有廣泛的溶劑相溶性,與蛋白質(zhì)鍵合作用低,非常低的可萃取性.在樣品溶液中有顆粒存在會(huì)造成故障時(shí)要用膜進(jìn)行過(guò)濾。

“漏" 分兩種：漏液和漏氣

漏液：液相色譜儀從流動(dòng)相瓶到廢液瓶之間的流路是一個(gè)全封閉體系，內(nèi)部壓力很高，但外部卻能保證一滴不漏。如果某個(gè)部件發(fā)生漏液，那就是故障所在。

漏液的原因分兩種：

接觸硬件不當(dāng)：在更換零件如流路管或換柱時(shí)，換的接頭接口不匹配，造成漏液。要注意不同公司的柱子接頭很多是不同的，甚至同一家公司在不同時(shí)期生產(chǎn)的液相柱接頭也有很大區(qū)別。當(dāng)然選項(xiàng)用PEEK接頭是一較好是一個(gè)較好的解決方法，不僅通用性好，而且靠手?jǐn)Q就能保證不漏液。即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不當(dāng)也會(huì)漏液，一種不當(dāng)就是力度把握不好，擰得太緊或太松；另一種不當(dāng)就是致命的錯(cuò)誤：滑絲，這往往是動(dòng)手能力不太強(qiáng)，螺絲釘很少擰的工作者犯的錯(cuò)誤，滑絲的后果不僅是漏液那么簡(jiǎn)單，常造成重要部件的報(bào)廢。解決這個(gè)問(wèn)題只能靠惡補(bǔ)基本功來(lái)實(shí)驗(yàn)，那就是擰螺絲。

使用儀器不當(dāng)：只要互相有10%比例就不會(huì)出現(xiàn)這個(gè)問(wèn)題。另一原因是在用緩沖液鹽溶液（不論甲醇含量有多少）作流動(dòng)相時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后沒(méi)有換甲醇水沖洗，使得微滲的流動(dòng)相干燥形成晶體造成。不過(guò)，輸送泵漏液并不是非得馬上修不可，沖洗干凈并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。檢測(cè)器漏液是個(gè)很麻煩的事，一般都是吸收池的問(wèn)題，更換的費(fèi)用相當(dāng)高。但是并不是說(shuō)一定要馬上更換，還可以從實(shí)際實(shí)驗(yàn)效果看能否湊合使用。

漏氣：漏液是從內(nèi)部向外漏，而漏氣則是外部了的氣體進(jìn)入液相色譜儀的流路內(nèi)部形成氣泡。下面按流路的方向逐個(gè)部件分析產(chǎn)生氣泡的原因和相應(yīng)解決方法。

2.1過(guò)濾頭：油液時(shí)，在流路管中有不規(guī)則但持續(xù)的小氣泡產(chǎn)生，這時(shí)考慮的是流動(dòng)相有沒(méi)有脫氣（需要特別提醒即使是有了真空脫氣機(jī)也是要先超聲脫氣的，起碼可以減少脫氣機(jī)的工作壓力并提高工作效率），如果已經(jīng)脫砂壓力了氣，則要注意過(guò)濾頭的污染也會(huì)造成這種現(xiàn)象。處理方法比較簡(jiǎn)單，擰下過(guò)濾頭在稀硝酸中浸泡，超聲半小時(shí)，洗凈后裝回去即可。

2.2透明流路管：指的是在過(guò)濾頭和輸送泵之間的那一段管路。這一個(gè)部分往往不是有點(diǎn)氣泡，而經(jīng)常是整個(gè)管中全是空氣而操作人員卻渾然不知，以致輸送泵工作了半天才發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相瓶里的液體一點(diǎn)也沒(méi)少。這也是我們常說(shuō)的液相色譜儀至少一周要開(kāi)機(jī)一次的原因（我們做液相一定要有“微滲"的概論）。如果長(zhǎng)時(shí)間不用，這一段管路的液體會(huì)徹干掉，而充滿空氣的管路和充滿液體的管路不仔細(xì)看是分辨不出來(lái)的。這種情況對(duì)于輸送泵很危險(xiǎn)，因?yàn)楸脧脑O(shè)計(jì)來(lái)說(shuō)是輸送液體而不是輸送氣體，內(nèi)部的液體對(duì)于活塞來(lái)說(shuō)起到了機(jī)油的作用，如果活塞桿還殘存了一些緩沖鹽，則極易拉傷，造成不可逆轉(zhuǎn)的影響。對(duì)于這種情況，要突出“預(yù)防為主"如：液相色譜使用人員要相對(duì)固定和穩(wěn)定，工作中合理搭配資源，每臺(tái)機(jī)一周至少一次實(shí)驗(yàn)，如長(zhǎng)期不用起碼每周要沖流動(dòng)相2小時(shí)。養(yǎng)成良好的工作習(xí)慣很重要。

如果流路管中真漏氣了怎么辦？

建議是用外力使管路中充滿液體。具體如下：

1、找到流路管進(jìn)入輸送泵的接頭。

2、擰下來(lái)。

3、用一干凈洗耳球?qū)?zhǔn)管路的平整切口。

4、吸液體，看液面從流動(dòng)相瓶里上升，至離洗耳球5cm左右時(shí)停止該動(dòng)作。

5、快速把接頭擰回輸送泵上（這個(gè)過(guò)程可能會(huì)有少許流動(dòng)相外泄，這是正?，F(xiàn)象）。

6、開(kāi)機(jī)，打開(kāi)排液閥門(mén)，啟動(dòng)輸送泵。

7、等排液管中流出的溶液沒(méi)有氣泡時(shí)，再關(guān)閉排液閥，儀器正常工作。

2.3輸送泵和柱子：這些部分進(jìn)了氣泡一般不怕，沖掉就行。

2.4檢測(cè)器：應(yīng)該說(shuō)，整個(gè)流路中只要有一個(gè)氣泡都會(huì)在檢測(cè)器上得到強(qiáng)烈的信號(hào)反映，檢測(cè)器內(nèi)部的氣泡一般都能被沖走，但也有很難沖掉的殘留氣泡的情況。如果檢測(cè)器內(nèi)有殘留氣泡，會(huì)有特別明顯的表現(xiàn)形式，就是在走基線時(shí)會(huì)時(shí)不時(shí)間隔出現(xiàn)直上直下信號(hào)很大的信號(hào)峰。這時(shí)先看普通流量能否沖走，如果沖不走，辦法就是拆柱，把檢測(cè)器直接連接到輸送泵的出口，加大幾部流量沖洗，則肯定能沖走氣泡。