小鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）酶聯(lián)免疫試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣本中小鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）的含量。

小鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）酶聯(lián)免疫試劑盒

l 本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣本中小鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）的含量。

l 有效期：6個月

l 保存條件：2-8℃

l 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷

 

實(shí)驗(yàn)原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被小鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。

小鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）酶聯(lián)免疫試劑盒準(zhǔn)備試劑與收集血樣

1.          收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等裂解產(chǎn)物盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。

2.          標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻，配成16000pg/ml的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，每管加入標(biāo)本稀釋液200ul。在*管中加入16000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液200ul混勻后用加樣器吸出200ul，移至第二管。如此反復(fù)作對倍稀釋，從第七管中吸出200ul棄去。第八管為空白對照。

3.          10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4.         洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

標(biāo)本激活方法

             1.   將450ul標(biāo)本稀釋液加入到一支1.5ml進(jìn)口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標(biāo)本。

 2.   加20ul 1 N HCI,蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60± 2分鐘。

     3.   加20ul 1 N NaOH,蓋緊，上下混勻。

     4.   即用，或放-20/-70℃保存3天。計(jì)算結(jié)果時乘以稀釋倍數(shù)50。（注意：不同的標(biāo)本HSP60的水平可能有較大差異，請根據(jù)實(shí)際情況靈活掌握稀釋度）

     5.   細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿10倍稀釋(410ul的標(biāo)本稀釋液＋50ul樣本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。

改良雙抗體夾心法

本法是雙抗體夾心法的一種改良形式，也是用于測定抗原的，其原理可用圖來表示。本法首先是將特異性抗體a包被于固相載體，經(jīng)洗滌加入含有欲測抗原之待檢樣品。經(jīng)孵育洗滌后再加一次未標(biāo)記的特異性抗體b，而這次加入的抗體b于*次包被于固相載體上的特異性抗體a對被測抗原來說都是特異性的，但不是用同種動物免疫制備的，否則可出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。經(jīng)孵育洗滌后，再加酶標(biāo)記抗b抗體，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色進(jìn)行測定。這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數(shù)更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。同時避免標(biāo)記特異性抗體，而另一優(yōu)點(diǎn)是只要標(biāo)記一種抗抗體，即可達(dá)到多種應(yīng)用。

檢測程序

1.          加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品（已激活）100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。

2.          洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。

3.          每孔中加入*抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。

4.          洗板：同前。

5.          每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。

6.          洗板：同前。

7.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。

8.          每孔加入100ul終止液混勻。

9.          30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。

結(jié)果計(jì)算與判斷

1.          所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。

2.          以標(biāo)準(zhǔn)品8000、4000、2000、1000、500、250、125、0 pg/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.          根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)HSP60含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。

試劑盒性能

             1.   靈敏度：zui小的HSP60 檢測濃度小于65pg/ml。

2.        特異性：可同時檢測重組或天然的人HSP60。不與人其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。

3.        重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于12％。

注意事項(xiàng)

             1.   以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測樣品均建議做復(fù)孔，每次測定應(yīng)同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 2.   洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致精確度誤差及OD值錯誤地升高。

             3.   板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

             4.   本試劑盒宜置4oC冰箱保存。

 5.   本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！