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人類免疫缺陷病毒1型p24抗原ELISA試劑盒
【產(chǎn)品名稱】
通用名：人類免疫缺陷病毒1型p24抗原酶聯(lián)免疫試劑盒
英文名：ENZYME IMMUNOASSAY FOR DETECTION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE I P24 ANTIGEN IN HUMAN SERUM, PLASMA AND CELL CULTURE SUPERNATANT
【包裝規(guī)格】
96人份/盒。
【預期用途】
本試劑盒用于人類免疫缺陷病毒1型p24抗原（Human Immunodeficiency Virus Type 1 p24 Antigen）的定量檢測，適用于人血清（或血漿）及細胞培養(yǎng)上清液等標本，僅供研究使用。
人類免疫缺陷病毒1型p24抗原ELISA試劑盒
【檢驗原理】
本產(chǎn)品采用固相酶聯(lián)免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測人血清（或血漿）中的游離HIV-1 p24抗原和細胞培養(yǎng)上清液等標本中的HIV-1 p24抗原。本分析方法是基于雙抗體夾心的非競爭性免疫分析。校準品和樣品中HIV-1 p24抗原與固相抗- p24單克隆抗體和生物素標記的抗-p24多克隆抗體通過免疫反應，形成固相抗-p24單克隆抗體—p24抗原—抗-p24多克隆抗體-生物素復合物；溫育后洗滌，洗去非特異或多余的抗原和多余的生物素標記的抗- p24多克隆抗體；然后加入HRP（Horseradish Peroxidase，辣根過氧化物酶）標記的鏈親和素，形成固相抗- p24單克隆抗體—p24抗原—抗-p24多克隆抗體-生物素—鏈親和素-HRP復合物；溫育后洗滌，洗去多余的HRP標記的鏈親和素。加入TMB-H2O2底物溶液，HRP催化H2O2氧化TMB生成藍色的產(chǎn)物（zui大吸收峰655nm），加入終止液終止酶催化反應，生成黃色產(chǎn)物（zui大吸收峰450nm）。其吸光度與校準品和樣品中的HIV-1 p24抗原濃度成正相關。通過劑量－反應曲線可得出樣品中HIV-1 p24抗原濃度。
試驗類型 | 溫育時間 | 試驗所需時間 | 試驗溫度 | 試驗所需樣本體積 |
免疫度量分析 | 120 分鐘 | 大約150分鐘 | 37°C 和室溫（18~30℃） | 75μL |
人類免疫缺陷病毒1型p24抗原ELISA試劑盒
【主要組成成份】
（Antibody Coated Microplate） | 1塊 | 包被有鼠抗-HIV-1 p24單克隆抗體的聚苯乙烯微孔板，約200ng/孔。8孔×12條。 鋁箔袋密封包裝，含干燥劑。標簽編號為R1。 |
（HIV-1 p24 Antigen Calibrator） | 1mL×1支 | 重組HIV-1 p24抗原溶液，200IU/mL（約相當于4,000pg/mL），稀釋液為校準品稀釋液。用英國國家生物標準與檢定所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC)提供的WHO標準品（HIV-1 p24 Antigen 90/636）校準。 綠色PP蓋子和無色PP塑料管。標簽編號為R2。 |
（Calibrator Diluent） | 20mL×1瓶 | 磷酸鹽緩沖液，含動物血清和鈣化的正常人血漿（經(jīng)ELISA檢測，HBsAg、抗-HCV和抗-HIV 1+2均為陰性），pH約7.3。防腐劑為NaN3（不超過0.1%）和EDTA。 綠色PP蓋子和無色HPDE塑料瓶。標簽編號為R3。 |
（Biotinylated Antibody） | 5mL×1瓶 | 生物素標記的兔抗-HIV-1 p24多克隆抗體，約4µg/mL。緩沖液為Tris-HCl，含動物血清、穩(wěn)定劑、表面活性劑和綠色染料，pH約7.4。防腐劑為NaN3（不超過0.1%）。 藍色PP蓋子和無色HPDE塑料瓶。標簽編號為R4。 |
（HRP Conjugated Streptavidin） | 20mL×1瓶 | HRP標記鏈親和素，約0.1µg/mL（25mU/mL HRP）。緩沖液為Tris-HCl，含動物血清、穩(wěn)定劑、表面活性劑和紅色染料，pH約7.4。防腐劑為ProClin®300（不超過1%）。 紅色PP蓋子和棕色HPDE塑料瓶。標簽編號為R5。 |
（Concentrated Wash Buffer） | 50mL×1瓶 | 含表面活性劑的磷酸鹽緩沖液，20倍濃縮。防腐劑為ProClin®300（不超過1%）。 無色PP蓋子和無色HPDE塑料瓶。標簽編號為R6。
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（Substrate Buffer） | 10mL×1瓶 | 含H2O2的乙酸鹽緩沖液，pH約5.0。 無色PP蓋子和無色HPDE塑料瓶。標簽編號為R7。 |
（Chromogen Solution） | 10mL×1瓶 | 含TMB的乙酸溶液，pH約3.0。 白色PP蓋子和棕色HPDE塑料瓶。標簽編號為R8。 |
（Stop Solution） | 10mL×1瓶 | 2mol/L H2SO4溶液。 黃色PP蓋子和無色HPDE塑料瓶。標簽編號為R9。 |
（Plate Sealer） | 6張 | 用于溫育時微孔板的密封。 |
（Instruction for Use） | 1份 | 本產(chǎn)品使用說明。 |
【儲存條件及有效期】
試劑盒置2~8℃保存，有效期為12個月。
【適用儀器】
酶標儀、洗板機、恒溫培養(yǎng)箱等。
【樣本要求】
- 樣本：人血清（或血漿）樣本，和細胞培養(yǎng)上清液等標本。
- 存放：樣本于2~8℃可儲存2天；樣本長期儲存應放置于-20℃或-20℃以下環(huán)境中，且不宜反復凍融5次以上。
【檢驗方法】
- 試劑配制方法
- HIV-1 p24校準品系列的配制：
取6支離心管，編號A、B、C、D、E和F。管F中取900µL校準品稀釋液，加入100µL HIV-1 p24校準品（200IU/mL，4,000pg/mL），混勻，作1:10稀釋，配制成校準品F（20IU/mL，400pg/mL）；管E中取500µL校準品稀釋液，加入500µL校準品F，混勻，作1:2稀釋，配制成校準品E（10IU/mL，200pg/mL） ；管D中取500µL校準品稀釋液，加入500µL校準品E，混勻，作1:2稀釋，配制成校準品D（5IU/mL，100pg/mL）；管C中取500µL校準品稀釋液，加入500µL校準品D，混勻，作1:2稀釋，配制成校準品C（2.5IU/mL，50pg/mL）；管B中取500µL校準品稀釋液，加入500µL校準品C，混勻，作1:2稀釋，配制成校準品B（1.25IU/mL，25pg/mL）；以校準品稀釋液作為校準品A。共配制成6個濃度的HIV-1 p24校準品系列（A-F）：A 0、B 1.25IU/mL（25pg/mL）、C 2.5IU/mL（50pg/mL）、D 5IU/mL（100pg/mL）、E 10IU/mL（200pg/mL）和 F 20IU/mL（400pg/mL）。配制好的HIV-1 p24校準品系列應保存在2~8°C，于一月內(nèi)使用。
校準品濃度 | 離心管編號 | 校準品稀釋液 | 加入 |
20IU/mL（400pg/mL） | F | 900µL | 100µL R2 |
10IU/mL（200pg/mL） | E | 500µL | 500µL 管 F |
5IU/mL（100pg/mL） | D | 500µL | 500µL 管E |
2.5IU/mL（50pg/mL） | C | 500µL | 500µL 管D |
1.25IU/mL（25pg/mL） | B | 500µL | 500µL 管C |
- 工作濃度洗滌液的配制：
用純水（蒸餾水或去離子水）將濃縮洗滌液稀釋20倍，即為工作濃度洗滌液。工作濃度洗滌液應保存在2~8℃，于一月內(nèi)使用。
- 標準操作方法
- 從鋁箔袋中取出所需數(shù)量的微孔板條，裝至微孔板架上。設空白對照1孔，HIV-1 p24校準品A、B、C、D、E和F各2孔，其余各孔為待測樣品，建議每個待測樣品均設置2孔；編號標記。向各孔內(nèi)分別加入25μL的生物素標記抗體（空白對照孔不加），然后再向各孔內(nèi)分別加入75μL的HIV-1 p24校準品或待測樣品，輕輕振蕩微孔板，使內(nèi)容物充分混勻。
- 用封板膜將微孔板密封，置37℃溫育60分鐘。
- 棄去微孔板反應孔內(nèi)液體，每孔（含空白對照孔）加入350μL工作濃度洗滌液，然后將洗滌液棄去。重復洗板共5次，zui后拍干。
- 每孔加 HRP標記鏈親和素100μL（空白對照孔不加），用封板膜將微孔板密封，置37℃溫育30分鐘。
- 棄去微孔板反應孔內(nèi)液體，每孔（含空白對照孔）加入350μL工作濃度洗滌液，然后將洗滌液棄去。重復洗板共5次，zui后拍干。
- 每孔加底物緩沖液和顯色劑各50μL（含空白對照孔），用封板膜將微孔板密封，置室溫（18~30℃）避光溫育30分鐘。
- 每孔加終止液50μL（含空白對照孔），輕輕振蕩微孔板，使內(nèi)容物充分混勻。
- 終止反應后1小時內(nèi)，用酶標儀在450nm波長處，測定各孔吸光度值，參考波長選擇620-700nm。
- 數(shù)據(jù)處理
- 求出HIV-1 p24抗原校準品的吸光度平均值。
- 以HIV-1 p24抗原校準品的吸光度平均值為縱軸，以HIV-1 p24校準品的濃度為橫軸，在雙對數(shù)坐標圖上作出標準曲線。
- 如果待測樣品試驗了2孔，求出待測樣品的吸光度平均值。
- 將測得的樣品的吸光度值（或吸光度平均值）在上述標準曲線上求出樣品中的HIV-1 p24抗原的濃度。也可以通過軟件用zui小二乘法擬合曲線，求出樣品中的HIV-1 p24抗原的濃度。
【檢驗結果的解釋】
- 質(zhì)量控制：空白對照校準品吸光度值不高于0.050，A點（0pg/mL）吸光度值不高于0.100，F點（400pg/mL）吸光度值不低于1.000。
- 對于吸光度值超出校準品F點的樣品，可用校準品稀釋液稀釋適宜倍數(shù)后再行測定，樣本中HIV-1 p24抗原濃度值為稀釋后測定值×稀釋倍數(shù)。
【檢驗方法的局限性】
- 本品僅適用于研究用途，不用于臨床診斷。
- 本品僅適用于游離的HIV-1 p24抗原含量的檢測，不能用于總抗原含量的檢測。
- 樣本pH應保證在5-10之間，過低或過高的pH可能會造成HIV-1 p24抗原的測量值異常。
【產(chǎn)品性能指標】
- 測定范圍：0~400pg/mL。
- 分析靈敏度：zui低檢測限不高于5pg/mL。
- 校準品劑量-反應曲線的線性：線性相關系數(shù)R>0.9900。典型校準曲線如下圖
- 精密性：批內(nèi)變異系數(shù)（Within-Run CV）不高于10%，批間變異系數(shù)（Between-Run CV）不高于15%。
- 特異性：與HIV-1和HIV-2的env蛋白、pol蛋白和gag蛋白中的p17（1型）等無交叉反應。
- 膽紅素（Bilirubin，20mg/dL）、血紅蛋白（Hemoglobin，500mg/dL）和血脂（Triolein， 3,000mg/dL）對HIV-1 p24抗原的測量值無明顯干擾。
- 抗凝劑（肝素0.2mg/mL、檸檬酸鈉100mg/mL和EDTA 20mg/mL）對HIV-1 p24抗原的測量值無明顯干擾。
【注意事項】
- 本品僅適用于研究用途。
- 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，應平衡至室溫（18~30℃）后再使用。未用完的微孔條用自封袋密封保存。
- 儲存和溫育時應避光進行。
- 不得直接用手接觸終止液。若不慎接觸則應立即用大量自來水沖洗。
- 操作應迅速，加樣品時間過長、洗滌后放置太久均可能影響檢測結果的準確性。
- 每次測定均應做標準曲線。
- 操作應按說明書嚴格進行。嚴格控制反應溫度和時間，并盡量使用移液器加樣，結果判定以酶標儀讀數(shù)為準。
- 不同批號試劑請勿混用，不要使用過期試劑。
- 本品含有部分動物源性物質(zhì)，操作必須符合國家有關傳染性疾病檢測的實驗室管理及安全的規(guī)定，并按有關實驗室規(guī)程處理所使用組份及樣品。
