14
人生長激素釋放肽試劑盒
人生長激素釋放肽試劑盒，是一類用于檢測生物樣本中 ghrelin 含量的工具，在科研及部分臨床診斷輔助方面發(fā)揮重要作用 。
檢測原理：多采用酶聯(lián)免疫法中的雙抗夾心法。以純化的人生長激素釋放肽抗體包被微孔板，制成固相抗體。加入樣本后，樣本中的人生長激素釋放肽與固相抗體結(jié)合，接著加入 HRP 標(biāo)記的人生長激素釋放肽抗體，形成抗體 - 抗原 - 酶標(biāo)抗體復(fù)合物。經(jīng)過洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)，再加入底物 TMB 。在 HRP 酶的催化下，TMB 轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸作用下變?yōu)辄S色，顏色深淺與樣本中人生長激素釋放肽含量正相關(guān)，通過酶標(biāo)儀在 450nm 波長處測定吸光度（OD 值），依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出其含量 。
樣本類型
血清：全血樣品室溫放置 2 小時或 4℃過夜后，以 1000×g 離心 20 分鐘，取上清用于檢測。收集血液需用一次性無熱原、無內(nèi)毒素試管 。
血漿：常用 EDTA 或肝素抗凝，樣品采集后 30 分鐘內(nèi)，在 2 - 8℃以 1000×g 離心 15 分鐘，取上清。
組織勻漿：用預(yù)冷的 PBS（0.01M，pH = 7.4）沖洗組織，去除殘留血液（因勻漿中裂解紅細(xì)胞會干擾測量），稱重后剪碎組織。按約 1:9 的重量體積比（如 1g 組織對應(yīng) 9mL PBS，可按需調(diào)整并記錄），將剪碎組織與 PBS 加入玻璃勻漿器，于冰上充分研磨 。還可對勻漿液超聲破碎或反復(fù)凍融以進(jìn)一步裂解細(xì)胞，最后以 5000×g 離心 5 - 10 分鐘，取上清檢測 。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：以 1000×g 離心 20 分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，取上清檢測 。
操作流程
準(zhǔn)備工作：從冰箱取出試劑盒，提前 20 分鐘平衡至室溫；濃縮洗滌液若有結(jié)晶，室溫放置輕搖使其溶解后，按 1:20 用蒸餾水或去離子水稀釋 。
加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品 50μL，樣本孔加入待測樣本 50μL，空白孔不加樣 。
溫育與結(jié)合：除空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體 100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃溫育 60 分鐘 。
洗滌：棄去孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干，每孔加滿 350μL 洗滌液，靜置 1 分鐘，甩去洗滌液，吸水紙拍干，重復(fù)洗板 5 次（也可用洗板機） 。
顯色：每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15 分鐘 。
終止反應(yīng)與讀數(shù)：每孔加入 50μL 終止液，15 分鐘內(nèi)在 450nm 波長處測定各孔 OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣本濃度 。
性能指標(biāo)
檢測范圍：不同試劑盒有所差異，如部分為 25 pg/mL - 800 pg/mL 。
靈敏度：可低至能檢測出 10 pg/mL 甚至更低濃度 。
特異性：對人生長激素釋放肽特異性強，基本不與其他可溶性結(jié)構(gòu)類似物發(fā)生交叉反應(yīng) 。
重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)通常均小于 15% 。
注意事項
酶標(biāo)板袋拆封后，及時將不用板孔放回并加干燥劑保持干燥 。
初次使用試劑盒，先將其平衡至室溫，各試劑管離心數(shù)分鐘，使試劑集中到管底 。
TMB A 液需避光保存 。
洗板要充分，否則易導(dǎo)致假陽性 。
建議標(biāo)準(zhǔn)品、樣本均做雙份檢測 。
禁止混用不同批次試劑盒內(nèi)試劑 。