日本同仁Annexin V,FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品名稱：Annexin V,FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒

英文名稱：Annexin V,FITC Apoptosis Detection Kit

品牌：日本同仁化工

貨號(hào)：AD02-05

規(guī)格：盒

儲(chǔ)存條件：0-5℃

貨期：現(xiàn)貨

細(xì)胞凋亡是指為維持有機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。正常情況下，任何細(xì)胞在形成過(guò)程中發(fā)生的異常都會(huì)通過(guò)凋亡消除。例如，體內(nèi)的癌細(xì)胞增長(zhǎng)為腫瘤的過(guò)程會(huì)受細(xì)胞凋亡的引導(dǎo)而被抑制。然而，在抑癌基因p53出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，凋亡就不會(huì)誘導(dǎo)發(fā)生，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的不斷增長(zhǎng)。 細(xì)胞凋亡可以通過(guò)細(xì)胞形態(tài)的變化或生物化學(xué)的變化來(lái)檢測(cè)。目前常用的指標(biāo)有caspase活性變化、DNA碎片、磷脂酰絲氨酸的外翻等。

Annexin V染色的細(xì)胞可以用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡早期的細(xì)胞膜變化。在細(xì)胞凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。 Annexin V是一種Ca離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可以與磷脂酰絲氨酸特異結(jié)合。用綠色熒光FITC標(biāo)記的Annexin V通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可以檢測(cè)到細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種核酸染料，PI只能透過(guò)凋亡晚期和死細(xì)胞的細(xì)胞膜，因此Annexin V和PI結(jié)合使用，可以區(qū)分凋亡早晚期的細(xì)胞及死細(xì)胞。

操作流程

-懸浮細(xì)胞的操作流程

誘導(dǎo)凋亡的操作步驟

1.制備細(xì)胞 (Jurkat cell) 懸液 (1×106 cells/ml)

2.加入終濃度為1 ?g/ml的凋亡誘導(dǎo)劑 (Staurosuporine)

3.在37℃下培養(yǎng)3.5 h。

* Staurosuporine用于誘導(dǎo)Jurkat cell凋亡。*誘導(dǎo)條* Staurosuporine用于誘導(dǎo)Jurkat cell凋亡。*誘導(dǎo)條件請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞類型與誘導(dǎo)劑調(diào)整。   Annexin V染色操作步驟

1. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1,000 rpm離心3 min，去除上清液。

2. 加入PBS，1,000 rpm離心 3 min，去除上清液。再重復(fù)本步操作一遍。

3. 用之前準(zhǔn)備好的1×Annexin V Binding Solution制備細(xì)胞終濃度為1×106 cells/ml的細(xì)胞懸液。

* 細(xì)胞懸液體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖孕姓{(diào)整，一般推薦不少于500 ?l細(xì)胞懸液。

4. 取100 ?l步驟3中制備的細(xì)胞懸液，加入到一個(gè)新的tube中。

5. 向細(xì)胞懸液中加入5 ?l Annexin V,FITC結(jié)合物，再加入5 ?l PI Solution。

6. 室溫下避光培養(yǎng)15 min。

7. 加入400 ?l 1×Annexin V Binding Solution，請(qǐng)?jiān)?/SPAN>1 h內(nèi)檢測(cè)。

-貼壁細(xì)胞的操作流程

誘導(dǎo)凋亡的操作步驟

1. 制備細(xì)胞 (Caco-2) 懸液 (1×106 cells/ml)將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板中。

2. 在5% CO2培養(yǎng)箱中37℃預(yù)培養(yǎng)。

3. 加入終濃度為25 ?mol/ml的凋亡誘導(dǎo)劑 (Cisplatin)。

4. 37℃培養(yǎng)4 days。

* Cisplatin用于誘導(dǎo)Caco-2 cell凋亡。*的誘導(dǎo)條件請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞類型與誘導(dǎo)劑調(diào)整。

Annexin V染色操作步驟

1. 吸取培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中的上清液丟棄或轉(zhuǎn)移至微型管中保存。

2. 用PBS洗細(xì)胞2次，丟棄或收集清洗液保存。

3. 用胰蛋白酶消化細(xì)胞。

4. 用適量的培養(yǎng)基或PBS將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，如果*步的上清液和第二步的清洗液沒(méi)有丟棄，可以一并加入。

5. 1,000 rpm離心3 min，棄上清。

6. 加入PBS后1,000 rpm離心3 min，棄上清。重復(fù)本步操作一遍。

7. 加入預(yù)先配好的1×Annexin V Binding Solution，制成終濃度為1×106 cells/ml的細(xì)胞懸液。

* 細(xì)胞懸液體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖孕姓{(diào)整，一般推薦不少于500 ?l細(xì)胞懸液。

8. 取100 ?l步驟7中的細(xì)胞懸液，加入到新的tube中。

9. 向細(xì)胞懸液中加入5 ?l Annexin V, FITC結(jié)合物，再加入5 ?l的PI Solution。

10. 室溫下避光培養(yǎng)15 min。

11. 加入400 ?l 1×Annexin V Binding Solution，請(qǐng)?jiān)?/SPAN>1 h內(nèi)檢測(cè)。

備注：1. 上清液及清洗液中可能含有細(xì)胞或凋亡細(xì)胞，可以收集一起處理。

      2. 離心后如果無(wú)法判斷tube中是否含有細(xì)胞？可以保留上清液，以防檢測(cè)時(shí)沒(méi)有細(xì)胞，進(jìn)而得不到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

-設(shè)定對(duì)照

1. 未染色細(xì)胞。

2. Annexin V, FITC染色細(xì)胞 (沒(méi)有PI)。

3. PI染色細(xì)胞 (沒(méi)有Annexin V-FITC)。

-流式細(xì)胞儀檢測(cè)

1. 加樣到流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex = 488 nm；發(fā)射波長(zhǎng)Em = 530 nm。

2. Annexin V-FITC的綠色熒光通過(guò)FITC通道 (FL1) 檢測(cè)；PI的紅色熒光通過(guò)PI 通道 (FL2或FL3) 檢測(cè) (建議使用FL3)。

-熒光顯微鏡檢測(cè)

  將細(xì)胞懸液滴到玻片上，置于顯微鏡上使用合適的濾光片檢測(cè)。

* 由于EDTA會(huì)對(duì)細(xì)胞膜的特定部位有損傷，建議使用不含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞。

注意事項(xiàng)

1. PI有潛在的致癌性，操作時(shí)請(qǐng)?zhí)貏e注意并采取必要的防護(hù)措施。

2. Annexin V,FITC和PI均對(duì)光敏感。所有染色過(guò)程和培養(yǎng)過(guò)程均需避光。

3. 若細(xì)胞收集過(guò)程中使用胰酶，需設(shè)法去除殘留的胰酶，這些胰酶會(huì)消化并降解Annexin V, FITC，zui終導(dǎo)致染色失敗。