NobleRyder  FQ-PCR05-1  染料法qPCRMix  2× Universal SYBR qPCR Master Mix  1mL

產(chǎn)品品牌：NobleRyder

產(chǎn)品貨號(hào)：FQ-PCR05-1

產(chǎn)品名稱：染料法qPCRMix

英文名稱：2× Universal SYBR qPCR Master Mix

產(chǎn)品規(guī)格：1mL

NobleRyder  染料法qPCRMix

產(chǎn)品內(nèi)容：

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

2× Universal SYBR qPCR Master Mix是使用SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行qPCR的2×試劑。主要成分包括化學(xué)修飾的Hot Start Fast Taq DNA Polymerase、dNTP、Mg²⁺、SYBR Green I和針對(duì)qPCR優(yōu)化的最適Buffer。本產(chǎn)品可在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好、可信度高。另外，預(yù)混液體系中添加了特殊ROX Reference Dye，適用于不同qPCR 儀器，配置反應(yīng)體系時(shí)只需加入引物和模板即可擴(kuò)增。

注意事項(xiàng)

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前確保產(chǎn)品wan全解凍，徹di混勻后短暫離心，置于冰上備用。

3. 反復(fù)凍融會(huì)影響產(chǎn)品性能。如每次用量較少，推薦小份分裝使用。

4. 本產(chǎn)品中含熒光染料SYBR Green I，使用中應(yīng)盡量避免強(qiáng)光照射。

實(shí)驗(yàn)流程

配制檢測(cè)試劑

1.    按照下表配置PCR反應(yīng)體系（注：配置多個(gè)反應(yīng)孔時(shí)，請(qǐng)為各組分預(yù)留10%的余量，以免移液損失。）

*通常每條引物終濃度為0.2 μM，也可根據(jù)情況在0.1~0.4μM 間進(jìn)行調(diào)整。

*微量體積加樣時(shí)誤差大，建議模板稀釋后再加入反應(yīng)體系中，這樣可以有效提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性；如模板類(lèi)型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過(guò)qPCR反應(yīng)總體積的 1/10。

2. 反應(yīng)體系配好后，蓋好反應(yīng)蓋，充分渦旋混勻，離心，避免產(chǎn)生氣泡。

反應(yīng)程序設(shè)置

標(biāo)準(zhǔn)程序

快速程序

*延伸時(shí)間請(qǐng)根據(jù)您使用的Real Time qPCR儀數(shù)據(jù)采集最短時(shí)間限制以及PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度自行調(diào)整。

*模板拷貝數(shù)較低時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)程序可提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。

結(jié)果分析

定量檢測(cè)至少需要三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后需要確認(rèn)擴(kuò)增曲線的線形，熔解曲線的峰形。

1. 擴(kuò)增曲線：標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線為S型。

Ct值小于10，需要將模板稀釋后，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（每稀釋一倍，Ct值增大1）；

Ct值30-35之間時(shí)，需要提高模板濃度，或者增大反應(yīng)體系的體積，以提高擴(kuò)增效率，保證結(jié)果分析的準(zhǔn)確性；

Ct值大于35時(shí)，檢測(cè)結(jié)果不可信。

2. 熔解曲線：

熔解曲線單峰，表明反應(yīng)特異性好可以進(jìn)行定量結(jié)果分析；若熔解曲線出現(xiàn)明顯雙峰或者多峰，則不能進(jìn)行定量分析，需要重新設(shè)計(jì)引物。

常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

?擴(kuò)增曲線形狀異常

①擴(kuò)增曲線不光滑：使用的八聯(lián)排管或PCR板可能與設(shè)備不匹配，設(shè)備光源可能松動(dòng)。

②擴(kuò)增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，樣本離心后仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。

?反應(yīng)結(jié)束無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)

①循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)置為40個(gè)循環(huán)。

②確認(rèn)程序中是否設(shè)置了信號(hào)采集步驟。

③確認(rèn)引物、模板是否降解。

?陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增

①反應(yīng)體系污染：更換新的Mix、水、引物重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在超凈工作臺(tái)進(jìn)行反應(yīng)體系配置，減少氣溶膠污染。

②產(chǎn)生引物二聚體，配合溶解曲線進(jìn)行分析。

③使用含UDG/dUTP 防污染體系的擴(kuò)增試劑。

?實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差

①加樣體積失準(zhǔn)：建議使用大體積加樣以減少誤差。

②模板濃度太低：模板濃度越低，重復(fù)性越差，減少模板稀釋倍數(shù)或增加模板體積。

③反應(yīng)體系未充分混勻：上機(jī)檢測(cè)前將反應(yīng)體系充分混勻后再離心。

產(chǎn)品訂購(gòu)信息：

NobleRyder  FQ-PCR05-1  染料法qPCRMix  2× Universal SYBR qPCR Master Mix  1mL

NobleRyder  FQ-PCR05-5  染料法qPCRMix  2× Universal SYBR qPCR Master Mix  5mL

NobleRyder  FQ-PCR06-1  染料法qPCRMix  2× miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix  1mL

NobleRyder  FQ-PCR06-5  染料法qPCRMix  2× miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix  5mL

NobleRyder  FQ-PCR07-1  染料法qPCRMix  2x Blue Universal SYBR qPCR Master Mix  1mL

NobleRyder  FQ-PCR07-5  染料法qPCRMix  2× Blue Universal SYBR qPCR Master Mix  5mL

NobleRyder  染料法qPCRMix