培養(yǎng)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞攻略

1. C57Bl/6小鼠
2. 處死小鼠，75%酒精浸泡10min
3.解剖取出小鼠股骨和脛骨
4.去除骨上組織
5.沖洗骨髓腔，直至骨變白
6.收集的細(xì)胞沉淀以10000/ml細(xì)胞數(shù)接種，培養(yǎng)液含200U/mlrmGM-CSF和IL-4
答：
不知道U和ng之間是如何換算的呢，因?yàn)槲矣玫氖荝&D的細(xì)胞因子，是以ng為單位的，是否像論壇上有戰(zhàn)友所說(shuō)的1U＝1ng呢？

答：活性單位是個(gè)效應(yīng)單位，是表示生物制品的活性的，和質(zhì)量單位不是簡(jiǎn)單換算關(guān)系。
有生物活性的物質(zhì)，往往可殺死生物（如抗生素可殺死細(xì)菌）或促進(jìn)生物增殖作用（多數(shù)細(xì)胞因子可促進(jìn)細(xì)胞增殖）。在活性檢測(cè)時(shí)，設(shè)定一個(gè)濃度剃度，測(cè)得zui小致死量（如：抗生素）或zui大有效量也稱(chēng)飽和有效量（如：某些細(xì)胞因子）的濃度，然后取中位數(shù)（即半數(shù)致死量或半數(shù)有效量）的倒數(shù)就是活性單位。如：R&D的說(shuō)明書(shū)注明GM-CSF的Activity（活性）：ED50 =10 - 60 pg/mL(ED50，ED是zui大有效量，50表示50％，ED50就是半數(shù)zui大有效量）。你取其倒數(shù)，就可算出它的活性單位了，因此，它活性遠(yuǎn)超1U/ng。
生物制品的活性不是固定不變的，不同的公司、不同的批次，其活性都不同，其中R&D的細(xì)胞因子活性是比較好的，也是比較穩(wěn)定的。
有幾點(diǎn)有點(diǎn)改變:
1 骨髓洗出來(lái)后,可以用200目的濾膜濾一次,有些操作中的渣子,碎片會(huì)被濾掉
2 樓主好像沒(méi)有測(cè)過(guò)(還是我沒(méi)看到)在細(xì)胞因子刺激的細(xì)胞總共中有多少表達(dá)CD11c,樓主是否用磁珠之類(lèi)的東西富集過(guò)?我原來(lái)測(cè)過(guò),小鼠骨髓來(lái)源細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子GM-CSF及IL-4作用二天后,CD11C表達(dá)大約20-40%之間.并不是所有的細(xì)胞都是DC.另外,淋巴細(xì)胞不加IL-2只有IL-4也可以存活三到四天,只是狀態(tài)比較差.
3 關(guān)于DC的形狀:其實(shí)DC基本沒(méi)有固定的形狀,我見(jiàn)過(guò)有梭形的,三角形的,四角形,有些形狀都不好說(shuō)什么形,各種各樣的都有.不過(guò)很少有純圓形的,特別是貼壁后.
4 關(guān)于細(xì)胞因子用量:各個(gè)實(shí)驗(yàn)室有不同的搞法,我們的用量是參考國(guó)內(nèi)做DCzui牛的實(shí)驗(yàn)室的用量(NAT IMMUNOLOGY):10ng/ml mGM-CSF和1ng/ml IL-4.效果很好.
5 關(guān)于TNF-a刺激成熟:zui常用的是TNF-a或LPS,原理有所區(qū)別:TNF是通過(guò)刺激DC表面的TNFR誘導(dǎo)細(xì)胞成熟,LPS則是通過(guò)刺激DC表面的TLR2,TLR4誘導(dǎo)DC成熟.成熟標(biāo)志:CD80,CD86
6 關(guān)于抗原提呈:成熟DC也有抗原吞噬能力,只不過(guò)比未成熟DC弱.而未成熟DC亦有抗原提呈能力,只不過(guò)比成熟DC差.只是功能有偏向,并不是*沒(méi)有.
流式的本質(zhì)是檢測(cè)細(xì)胞的分群。表現(xiàn)在流式的直方圖（如下圖）就是一個(gè)個(gè)“峰”，流式的直方圖就是分析這些“峰”，而是不是抽象地、孤立地見(jiàn)百分比。其實(shí)百分比是是一個(gè)很不清楚的概念。我們用流式檢測(cè)DC和DC的成熟程度，必須同時(shí)從兩方面來(lái)看，即峰的形態(tài)和峰的位置，而不是百分比，講百分比必須是某一細(xì)胞群占總體的百分比。任何時(shí)候離開(kāi)細(xì)胞群（即圖上的“峰”）的概念談百分比，都是毫無(wú)意義的，沒(méi)有一點(diǎn)價(jià)值。
借用丁香園某網(wǎng)友（具體哪位網(wǎng)友記不清了，不好意思）的流式圖談?wù)勎覍?duì)流式的理解。流式直方圖中，橫坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，即結(jié)合窄細(xì)胞上熒光抗體的多寡，也即細(xì)胞表達(dá)的抗原的多寡；縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)量。從圖中可以看出，峰底比較窄，約為兩個(gè)數(shù)量級(jí)（如：左圖101～103，右圖102.5~104.5），說(shuō)明大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)的表面分子數(shù)量比較一致，如左圖中94.7%的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在101～102.8，另外，只有5.3％的細(xì)胞（少數(shù)細(xì)胞）熒光強(qiáng)度比較高，在102.8～103.1，峰頂在102.2左右，表明熒光強(qiáng)度為102.2的細(xì)胞數(shù)zui多，因?yàn)樵摲逵悬c(diǎn)類(lèi)似正態(tài)分布，因此，102.2近似于中位數(shù)和平均數(shù)，即平均熒光強(qiáng)度為102.2;右圖94.7%的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在102.8~104.5，5.3％的細(xì)胞（少數(shù)細(xì)胞）熒光強(qiáng)度比較低，在102.8以下，熒光強(qiáng)度為103.5的細(xì)胞數(shù)zui多。也就是說(shuō)：與右圖相比，左圖（不成熟DC）的細(xì)胞總數(shù)中大多數(shù)細(xì)胞（94.7%）熒光強(qiáng)度比右圖（成熟DC）低，即：右圖中絕大多數(shù)細(xì)胞高表達(dá)CD11c（圖A）和CD86（圖B）。這就是不成熟DC和成熟DC的區(qū)別：這個(gè)窄而高的“峰”右移了，即大多數(shù)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度提高了。
如果你不管流式的圖形（即細(xì)胞的分群，即峰的形態(tài)和位置）情況，光講百分比，那么左圖和右圖就沒(méi)有差別了，都是94.7%，有何意義？
另外，講百分比，一定要講某一區(qū)域的細(xì)胞占總數(shù)的百分比。如上圖，熒光強(qiáng)度為101～102.8的細(xì)胞占總數(shù)的百分比，如果取熒光強(qiáng)度為101～103.1d的細(xì)胞，那么就是100％。如圖C，如果取熒光強(qiáng)度為101～103.1（如圖C示）約70％，這群細(xì)胞比較一致，和103.1~105的細(xì)胞是有區(qū)別的；但如果熒光強(qiáng)度取101～104.5那就達(dá)到90％了；該圖中就全體細(xì)胞來(lái)說(shuō)分布比較分散，從101～105都有，有低表達(dá)，有高表達(dá)，從峰的形態(tài)看可分為高表達(dá)和低表達(dá)的兩群。因此，離開(kāi)峰的形態(tài)和位置談百分比，可以說(shuō)是毫無(wú)意義的。