【免疫熒光】技術(shù)全解—染色篇

免疫熒光技術(shù)既有抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，又能在熒光顯微鏡下清晰地顯示其形態(tài)，直觀性強(qiáng)。該方法可用于組織學(xué)中抗原或抗體的定位，也可用于體液標(biāo)本中抗原或抗體的定量檢測。

一：熒光抗體染色

于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體。置濕盒內(nèi)，在一定溫度下溫育一定時(shí)間，一般可用
25～37℃ 30min，不耐熱抗原的檢測則以4℃過夜為宜。用PBS 充分洗滌干燥。

熒光顯微鏡檢查應(yīng)在通風(fēng)良好的暗室內(nèi)進(jìn)行。經(jīng)熒光抗體染色的標(biāo)本應(yīng)在染色當(dāng)天鏡檢，每次鏡下觀察時(shí)間以1～ 2h 為宜，時(shí)間過長將使高壓汞燈的發(fā)光亮度下降，熒光減弱，工作人員觀察過久對眼睛也有不良影響。作油鏡檢查時(shí)，必須用無自發(fā)熒光的鏡油。

二：影響熒光抗體染色的各種因素

. pH   熒光素在溶劑中基本上處于離子化狀態(tài)，因此，溶劑中的氫離子濃度對熒光強(qiáng)度的影響是極大的。每一種熒光素都有自己合適的pH值，它保持熒光素分子與溶劑之間的電離平衡。pH的改變可以引起熒光素?zé)晒夤庾V的改變，并可造成熒光強(qiáng)度的降低。

. 溫度   一般情況下，環(huán)境溫度的升高對熒光染色有明顯的影響。因?yàn)?，溫度升高可造成溶液粘滯性增加，溶劑和熒光素分子的動力增大，使熒光淬滅的可能性隨之加大，這就使熒光素分子與其他分子之間的相互碰撞幾率增加，因此，影響了熒光素的熒光強(qiáng)度。一般情況下，溫度在20℃時(shí)，熒光素即開始表現(xiàn)溫度淬滅作用。隨溫度升高，熒光淬滅作用就越強(qiáng)，可至熒光*淬滅。溫度在20℃以下，熒光素的熒光強(qiáng)度隨溫度的變化改變不明顯，基本上保持恒量。因此，在適當(dāng)?shù)牡蜏丨h(huán)境中進(jìn)行熒光顯微觀察，可得到更好的效果。

. 熒光素的濃度   在溶液濃度較稀時(shí)，熒光強(qiáng)度隨熒光素濃度增加而增加。當(dāng)熒光素濃度增加到一定程度時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到zui大。再繼續(xù)增加濃度，熒光素發(fā)生的光可能被鄰近的分子吸收，使熒光強(qiáng)度下降。

. 某些細(xì)胞固定劑對熒光素有明顯影響   如甲醛固定的細(xì)胞比不固定的細(xì)胞熒光強(qiáng)度減弱50%左右。雖然醇類固定劑也有輕微的淬滅熒光作用，但其影響較小。

. 非特異性熒光染色   免疫熒光染色除特異性熒光之外，還出現(xiàn)一些與靶抗原-抗體反應(yīng)無關(guān)的熒光，統(tǒng)稱為非特異性熒光。非特異性熒光染色可由于某些抗原的自發(fā)熒光及交叉反應(yīng)等多種因素產(chǎn)生。有些非特異性熒光染色可通過對照進(jìn)行鑒別與排除，有些則要通過對抗原的純化、抗體的提純、提高熒光抗體結(jié)合物的比例等方面尋找原因逐項(xiàng)清除。