人促血管生成素2(ANG2)ELISA試劑盒說明書

人促血管生成素2(ANG2)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說明書               96t

目    的：                                             

       本試劑盒用于測(cè)定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中人促血管生成素2(ANG2)的含量。

檢測(cè)范圍：                                         

5.0ng/L -100ng/L

實(shí)驗(yàn)原理：

       本試劑盒應(yīng)用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中人促血管生成素2(ANG2)水平。用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入人促血管生成素2(ANG2)，再與  HRP  標(biāo)記的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物  TMB  顯色。TMB  在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，   并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。   顏色的深淺和樣品中的人促血管生成素2(ANG2)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在  450nm  波長下測(cè)定吸光度（OD  值）  ，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人促血管生成素2(ANG2)濃度。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1.  血清：室溫血液自然凝固  10-20  分鐘，離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）  。

仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2.  血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇  EDTA  或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合  10-20  分鐘后，

離心 20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）  。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

3.  尿液：用無菌管收集，離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）  。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4.  細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心  20  分鐘左右（2000-3000 

轉(zhuǎn)/分）  。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用  PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到  100  萬/ml  左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）  。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5.  組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的  PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保

存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持  2-8℃的溫度。加入一定量的  PBS（PH7.4）  ，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心  20  分鐘左右（2000-3000  轉(zhuǎn)/分）  。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

6.  標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能

馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7.  不能檢測(cè)含  NaN3  的樣品，因  NaN3  抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟：

1.  標(biāo)準(zhǔn)品：其濃度為1,00pg/mL(貯液)。先將其稀釋為100pg/mL(標(biāo)準(zhǔn)曲線zui高濃度)后，再準(zhǔn)備5個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP 管，每個(gè)EP 管中加入150μL 的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成100pg/mL, 50pg/mL,25pg/mL, 12.5pg/mL, 6.25pg/mL, 3.12pg/mL,，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液

 2.  加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）  、待

測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液  40μ l，然后再加待測(cè)樣品  10μ l（樣品zui終稀釋度為  5  倍）   。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.  溫育：用封板膜封板后置  37℃溫育  30  分鐘。

4.  配液：將  20  倍濃縮洗滌液用蒸餾水  20  倍稀釋后備用。

5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置  30  秒后棄去，

如此重復(fù)  5  次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑  50μ l，空白孔除外。

7.  溫育：操作同  3。

8.  洗滌：操作同  5。

9.  顯色：每孔先加入顯色劑  A50μ l，再加入顯色劑  B50μ l，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色 15  分鐘.

10.  終止：每孔加終止液  50μ l，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）  。

11.  測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm  波長依序測(cè)量各孔的吸光度（OD  值）  。  測(cè)定應(yīng)

在加終止液后  15  分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

注意事項(xiàng)：

1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡  15-30  分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后

如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間

控制在  5  分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本  OD 

值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的  OD  值）  ，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n  倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）  。

5．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．  底物請(qǐng)避光保存。

7．  嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn). 

8．  所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9．  本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

計(jì)算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD  值為縱坐標(biāo)，

在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的  OD

值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋

倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與  OD  值計(jì)算出標(biāo)

準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的  OD  值

代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋

倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

（此圖僅供參考） 

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)  R  值為  0.990  以上。

2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于  9%和  11%

3.保存條件及有效期：

a.試劑盒保存：2-8℃。

b.有效期：6  個(gè)月