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概述：

生命誕生于3D環(huán)境，所以傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)方法，雖然可以保證細(xì)胞的生長(zhǎng)和對(duì)外界刺激產(chǎn)生生理反應(yīng)，但是和實(shí)際生活環(huán)境的巨大差異會(huì)導(dǎo)致大部分生理功能受限。比如，2D培養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞間的相互作用是XY軸的，只是細(xì)胞層之間的作用，缺乏Z軸方向的影響，這樣就沒有養(yǎng)料、氧氣和外界刺激物（如：藥物處理）的梯度滲透作用。而3D培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞可以變成細(xì)胞球，從而可以體現(xiàn)出Z軸細(xì)胞之間的力作用和各種物質(zhì)的滲透梯度，和體內(nèi)的差異相較2D細(xì)胞層會(huì)大大縮小，從而提高體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。利用體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞來高通量的篩選新的有效的藥物對(duì)于挽救癌癥病人非常重要。

本期小愛帶大家學(xué)習(xí)腫瘤球培養(yǎng)過程：以乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7為例制備3D多細(xì)胞腫瘤球并采用倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)表征。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作

1、提前24h取12mL DMEM(abs9483)和RPMI 1640(abs9484)培養(yǎng)基（含10%FBS(abs972)，下同）于50mL離心管內(nèi)，置于4℃冰箱中預(yù)冷；
2、將分裝好的Matrigel基質(zhì)膠(abs9490)提前24h從-20℃放入4℃，使其融化成液體狀態(tài)；
3、將無菌的1mL移液器槍頭放入無菌50mL離心管內(nèi)，置-20℃冰箱預(yù)冷。

二、瓊脂糖包被96孔板

1、準(zhǔn)確量取6mL RPMI 1640培養(yǎng)基（或DMEM培養(yǎng)基）于2個(gè)10mL的注射玻璃瓶?jī)?nèi)，加入90mg瓊脂糖(abs44056213)，蓋塞后放入80℃的水浴鍋內(nèi)加熱溶解30min；
2、加熱結(jié)束后，將注射瓶放入滅菌鍋內(nèi)，115℃滅菌30min；
3、滅菌完成后，迅速取出注射瓶放入超凈臺(tái)內(nèi)。將注射瓶?jī)?nèi)的瓊脂糖溶液倒入無菌的加樣槽中，用多通道移液器以每孔60μL的量加入96孔板內(nèi)。

注意：由于瓊脂糖溶液在室溫時(shí)會(huì)凝固，因此從滅菌鍋內(nèi)取出瓊脂糖溶液后一定要快速轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi)并迅速加入至96孔板中。

此外，為保證加樣時(shí)瓊脂糖不冷卻，需要同時(shí)滅菌加樣槽和100μL的移液器槍頭。

4、加入完成后，96孔板要保持水平約30min使孔內(nèi)的瓊脂糖凝固。

三、配置含Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞懸液

1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞（或MCF-7細(xì)胞），胰蛋白酶(abs47014938)消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用RPMI 1640培養(yǎng)基（或DMEM培養(yǎng)基）將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至2.0×10⁵cells/mL，備用；
2、將盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺(tái)內(nèi)，將RPMI 1640培養(yǎng)基以及解凍的Matrigel基質(zhì)膠從冰箱內(nèi)取出置于冰上。

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此在操作過程中一定要保持低溫。

3、將預(yù)冷的移液器槍頭取出放置于超凈臺(tái)內(nèi)。根據(jù)計(jì)算量（2.5%，v/v）用移液器將300μL Matrigel基質(zhì)膠加入到12mL RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)，迅速混勻。

注意：由于Matrigel基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此使用的移液器槍頭也需要預(yù)冷。

4、加入步驟1中的細(xì)胞懸液（約600μL），使細(xì)胞濃度為10000cells/mL，迅速混勻，備用；

四、將細(xì)胞懸液鋪入瓊脂糖包被的96孔板

1、將上述步驟4中配置好的含有Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞懸液放入加樣槽內(nèi)，用多通道移液器吸取200μL加入到包被瓊脂糖的96孔板內(nèi)；
2、采用微孔板離心機(jī)(abs72035)進(jìn)行離心，離心條件為4℃，1000×g，10min；

注意：離心96孔板時(shí)為保持無菌，將96孔板的周圍用封口膜封住。

3、離心完成后，取出96孔板，摘下封口膜，噴灑酒精后放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。整個(gè)培養(yǎng)流程如圖1所示；

圖1

4、在培養(yǎng)的第3、5和7天，更換孔內(nèi)的100μL培養(yǎng)基并采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的形態(tài)；

圖2

5、若要采用3D多細(xì)胞腫瘤球進(jìn)行藥物試驗(yàn)，在培養(yǎng)7天后，用移液器取出孔內(nèi)的100μL培養(yǎng)基，加入100μL給藥溶液，然后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并定期采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的生長(zhǎng)狀況（圖2）。

五、3D多細(xì)胞腫瘤球的表征

1、倒置顯微鏡觀察3D多細(xì)胞腫瘤球形態(tài)：直接將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察即可；
2、激光共聚焦顯微鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球，用PBS清洗3遍后，采用4%多聚甲醛(abs9179)固定，并用Hoechst 33258(abs47047617)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，PBS清洗3遍后在激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖3）。

圖3

3、環(huán)境掃描電鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球，用PBS(abs962)清洗3遍后，固定干燥后進(jìn)行環(huán)境掃描電鏡觀察（圖4）。

圖4

常見問題：

在實(shí)踐中，我們常常面臨細(xì)胞無法成球狀的問題。下面我們探討3D細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞不能成球狀的原因，以及針對(duì)這些問題的解決方法。

一、細(xì)胞類型和特性：

細(xì)胞的類型和特性是影響其在3D環(huán)境中形成球狀結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素之一。不同類型的細(xì)胞具有不同的自組織和黏附性能，可能更適合形成其他類型的3D結(jié)構(gòu)，如片狀、管狀等。

解決方法：在進(jìn)行3D培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之前，必須仔細(xì)選擇適合自組織的細(xì)胞類型。對(duì)于不易形成球狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，可以嘗試使用誘導(dǎo)因子或基因調(diào)控方法來促進(jìn)其自組織能力。

二、細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 缺乏或不適當(dāng)：

細(xì)胞成球狀通常需要適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)支持。如果培養(yǎng)基中的ECM成分不足或不適當(dāng)，細(xì)胞可能無法形成球狀。

解決方法：合理設(shè)計(jì)培養(yǎng)基中的ECM成分，確保細(xì)胞有足夠的支持來形成球狀結(jié)構(gòu)。此外，可以考慮添加外源性ECM支持物質(zhì)，如適當(dāng)?shù)?strong>基質(zhì)蛋白、生物活性的材料等。

三、細(xì)胞密度不足：

細(xì)胞成球狀可能需要足夠的細(xì)胞密度來支持細(xì)胞間的相互作用和自組織。如果細(xì)胞密度過低，可能會(huì)影響球狀結(jié)構(gòu)的形成

解決方法：優(yōu)化細(xì)胞接種密度，確保足夠的細(xì)胞數(shù)參與自組織過程。

四、培養(yǎng)條件不適當(dāng)：

培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基成分、溫度、氧氣濃度等可能會(huì)影響細(xì)胞成球狀的能力。不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件可能阻礙了細(xì)胞的自組織能力。

解決方法：通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，創(chuàng)造一個(gè)更有利于細(xì)胞自組織的環(huán)境，例如調(diào)整培養(yǎng)基成分、溫度和氣體濃度。

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