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免疫 (共) 沉淀 (IP/CoIP)

是基于抗體和蛋白的特異性親和作用，通過(guò)捕獲與蛋白或抗原特異性結(jié)合的抗體，進(jìn)而從復(fù)雜的樣品中捕獲及富集目標(biāo)蛋白，同時(shí)可以測(cè)定與之相互作用的蛋白或其它生物大分子的一種技術(shù)。

瓊脂糖珠VS磁珠

瓊脂糖珠作為免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中的固相支持物已經(jīng)歷經(jīng)多年，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，磁珠開(kāi)始大幅取代瓊脂糖珠，成為免疫沉淀純化方法的首先選擇，許多剛接觸的研究者都要面臨方法選擇的問(wèn)題，磁珠法VS瓊脂糖珠法，區(qū)別在哪里？分別有什么優(yōu)缺點(diǎn)？

圖1 瓊脂糖珠結(jié)構(gòu)

圖2 磁珠

區(qū)別：

1、抗體結(jié)合量：瓊脂糖珠（直徑50-150μm）明顯大于磁珠（直徑1-4μm），所以單個(gè)瓊脂糖珠結(jié)合抗體的量大于磁珠，但是磁珠每體積的磁珠比瓊脂糖珠的量多；
2、結(jié)合能力：瓊脂糖珠是多孔的海綿狀結(jié)果，與抗體的結(jié)合能力優(yōu)于磁珠；
3、非特異性結(jié)合：瓊脂糖珠的非特異性結(jié)合比磁珠多，樣品中的非目的蛋白或者抗體的任何部位都可能與之結(jié)合，所以在瓊脂糖珠法中，樣品的預(yù)處理非常重要；
4、抗體的損耗：瓊脂糖珠大于磁珠，由于瓊脂糖珠的多孔結(jié)構(gòu)，抗體很容易被困其中，并且，離心洗滌的過(guò)程中很容易流失；
5、實(shí)驗(yàn)時(shí)間：磁珠法可室溫短時(shí)間孵育（僅限Absin abs9649和abs955的比較）；
6、特殊設(shè)備：磁珠法需要自備磁力架。

abs9649（磁珠法）和abs955（瓊脂糖珠法）常見(jiàn)問(wèn)題：

圖 abs9649免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒(磁珠法)

圖 abs955免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒

以下問(wèn)題僅針對(duì)愛(ài)必信現(xiàn)有兩款試劑盒abs9649和abs955

一、樣品處理

1、兩個(gè)試劑盒中l(wèi)ysis buffer都要添加PMSF嗎，怎么使用？

兩個(gè)試劑盒中的PMSF都要額外準(zhǔn)備，推薦abs9146，根據(jù)使用量，取每1mL lysis buffer加入10ul PMSF（100mM，溶解174mg的abs9146于足量的異丙醇中，定容到10mL，分裝成小份貯存于-20℃。）使PMSF的最終濃度為1mM，混勻備用 （PMSF現(xiàn)用現(xiàn)加）。磁珠法緩沖液請(qǐng)按說(shuō)明書(shū)配置后使用，buffer稀釋均可用超純水。

2、abs9649如果沒(méi)有超聲破碎儀的話，能不能用酶解的辦法破碎細(xì)胞？

酶解和超聲都可以，酶按照實(shí)驗(yàn)室正常使用濃度配制即可。

3、蛋白的量如何估算？

可以使用BCA蛋白定量試劑盒(abs9232)。

4、如果我的細(xì)胞裂解物里面蛋白含量高于試劑盒要求的總蛋白含量，我應(yīng)該用什么試劑進(jìn)行稀釋呢？

常規(guī)用PBS稀釋即可。

二、如何減輕瓊脂糖珠非特異性吸附？

可以通過(guò)多次洗滌，和樣品預(yù)處理（適當(dāng)延長(zhǎng)Protein A和Protein G的孵育時(shí)間）來(lái)降低背景，但應(yīng)注意，選擇此步驟后，試劑盒中protein A和protein G對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)減半。

三、結(jié)合過(guò)程中，4℃混合過(guò)夜孵育可用什么儀器？

可以用混合儀abs72030或abs72019。

圖 abs72019旋轉(zhuǎn)混合儀(XHE-100)

四、abs955中beads出現(xiàn)吸不出來(lái)的情況，怎么處理？

吸之前需注意槍頭要剪一下再吸，如若beads吸不上來(lái)，可加入等體積的20%乙醇混勻后再吸。

五、如果我后續(xù)是想要跑native膠，不做變性電泳，如何選擇樣品緩沖液？

用不含有SDS的WB上樣緩沖液，但不經(jīng)過(guò)變性，蛋白能否解離下來(lái)，我們無(wú)法確定，不能保證您后續(xù)的實(shí)驗(yàn)效果。

六、磁珠法兩種洗脫方案的區(qū)別？

兩種洗脫方案均包含捕獲抗體及目的抗原，低pH 洗脫樣本中抗體為完整結(jié)構(gòu)，變性洗脫樣本中抗體解離為重鏈、輕鏈，請(qǐng)根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求選擇洗脫方案。

*文中圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，僅供學(xué)習(xí)參考用

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