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簡述：

流式細胞術(shù)是一種基于熒光的檢測的技術(shù)，能同時測定懸浮于溶液中的單個細胞的多種特性，例如細胞群計數(shù)和蛋白豐度。流式細胞術(shù)使用熒光偶聯(lián)抗體直接檢測抗原，每種抗體對應(yīng)細胞內(nèi)或細胞表面的不同蛋白，可實現(xiàn)細胞特性的快速、定量和準(zhǔn)確測定，并且提供針對細胞群異質(zhì)性的解讀，主要優(yōu)勢在于，它可以同時分析細胞群中的多個參數(shù)和多個不同的細胞標(biāo)志物。

圖1 流式示意圖

樣本處理：

針對流式細胞分析進行的樣品制備是一個關(guān)鍵步驟，樣本制備的好壞對最終的檢測結(jié)果有很大的影響。常見的的樣本多為外周血、骨髓、腦脊液、胸水、腹水以及淋巴結(jié)、脾、肝等，不同類型的樣本最好在12h內(nèi)進行處理，若無法及時處理，4℃保存，保存時間因樣品而異，最好不超過48h。

圖2 血液成分

以人的血液為例：

1、樣本收集后置于含抗凝劑（一般選擇肝素或EDTA）的試管中；

2、在15mL無菌離心管中加入淋巴細胞分離液(abs930) 5mL；（注意：淋巴細胞分離液使用前需恢復(fù)室溫，18-25℃）

3、Hank's液 (abs9257)或PBS緩沖液(abs962) 1:1比例（如果全血樣本粘稠，可適當(dāng)增大比例）稀釋抗凝過的全血樣品；

4、小心沿著壁管，接近分離液層面，非常緩慢地加入新鮮的稀釋過的4mL全血樣品在淋巴細胞分離液上面；（注意：切記不要攪渾淋巴細胞分離液）

5、小心放進離心機（水平轉(zhuǎn)子），4℃離心20-30min，速度為400g-1000g；（注意：離心機剎車應(yīng)取消，需等待自然停止）

6、取出離管，切記不要震動?？梢娚蠈訛榈t色透明血漿，其次為薄薄的只密白色環(huán)，白色環(huán)衛(wèi)單核細胞淋巴細胞；

7、棄上層，吸出PBMC層，加入PBS，洗1-2次。300g，10min，離心去上清，加入抗體進行染色。

圖3 abs930人淋巴細胞分離液

腦脊液、胸水、腹水等體液：

1、樣本收集至抗凝管中，室溫或4℃保存；

2、樣本1000-1500rpm離心5min，棄去上清；

3、加入含有0.1%牛血清白蛋白的PBS，1000-1500rpm離心5min進行洗滌；

4、加入適量PBS重懸。如有細小沉淀，用40um細胞篩網(wǎng)（300目，藍色） abs7231過濾后備用。

淋巴結(jié)、脾、肝等組織：

組織樣品比較常用酶消化和機械破碎的方法處理成單細胞懸液。程序參照細胞培養(yǎng)單細胞的制備，注意可用800-1000rpm 低速離心3min去除細胞碎片的影響。

封閉(abs9476)或(abs9477)

D16是低吸附的IgG FC受體 III(FcR III)，CD32是FC受體 II(FcR II)，CD16/CD32表達于B細胞、單核細胞、NK細胞、粒細胞、肥大細胞、樹突狀細胞（低水平）、Kupffer細胞、未成熟胸腺細胞和某些活化的成熟T淋巴細胞。FcR表達細胞在免疫熒光染色中有時出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，原因在于FcRs介導(dǎo)的Ig Fc結(jié)合性。

為阻斷Fc受體，100µL染色體積按照每10⁶個細胞加入0.25µg小鼠Fc受體阻斷劑，混勻，冰上孵育5-10min，之后用抗體進行染色。在此封閉和免疫染色步驟之間沒有必要進行細胞清洗。

固定(abs9110)、破膜(abs9111)

1、收貨待測細胞（流式細胞實驗，一般的細胞量就是控制在5*106-107個cell/mL； 做流式每管的細胞量可取100uL），1000rpm離心10min，棄上清；
2、加入500uL 4℃預(yù)冷的固定劑；
3、室溫避光孵育10min；
4、1000rpm離心10min；
5、棄上清，加入PBS洗一次，1000rpm離心10min；
6、棄上清，加入1.5mL破膜劑；
7、室溫孵育10-15min；
8、1000rpm離心5min；
9、棄上清，加入適量（100uL左右）破膜劑（注意加入的是破膜劑而非PBS）重懸細胞；
10、加入檢測抗體染色后，用流式細胞儀進行分析。

流式細胞常見問題

1、所有樣本在檢測之前都需要固定嗎？

我們一般在檢測胞內(nèi)指標(biāo)時需要固定破膜，特殊情況下，染完胞膜指標(biāo)已經(jīng)到很晚，可以對樣本進行固定處理，4℃放到第二天檢測，保持檢測指標(biāo)的穩(wěn)定性（如果染色的抗體顏色是耦聯(lián)染料（PE-Cy5、PE-Cy7、PerCp-Cy5.5）不能固定，因為耦聯(lián)染料在固定時會解偶聯(lián)，這會導(dǎo)致熒光染料降解。），當(dāng)樣本特別多的時候，間隔會很久，這種情況下上機前也可以做一下固定，保持前后數(shù)據(jù)的一致性，此外，在蛋白翻譯后修飾，如磷酸化、乙?；⒓谆鹊难芯窟^程中，固定劑可以固定住翻譯后修飾的位點，也可以防止目標(biāo)位點在活細胞中很快降解。

2、細胞染色緩沖液(abs9475)和pbs相比有什么優(yōu)點？

staining buffer是一種緩沖鹽水溶液，可用作抗體和細胞稀釋步驟，以及細胞表面染色和流式細胞分析的所有清洗步驟，含胎牛血清，減少抗體和熒光素對目的細胞的非特異性結(jié)合；還含疊氮鈉，是一種代謝抑制劑，能抑制細胞表面抗原的成斑和成帽現(xiàn)象。

成斑和成帽現(xiàn)象：在熒光免疫標(biāo)記試驗中，兩種膜蛋白熒光抗體混合后，由于膜蛋白的流動性，一段時間后，兩種熒光蛋白抗體均勻分布在質(zhì)膜上。時間繼續(xù)延長，抗體在細胞表面會重新分布，聚集在細胞的一定部位即所謂的成斑現(xiàn)象。經(jīng)過一段時間后，二價抗體在細胞膜表面相互交聯(lián)使被標(biāo)記的膜蛋白集聚在細胞的一端，即成帽現(xiàn)象。

3、用了Fc受體阻斷劑還需要做同型對照嗎？

同型對照抗體相當(dāng)于沒有特異靶標(biāo)的一抗作用是排除非特異性結(jié)合，包括：抗體與靶細胞上的 Fc受體結(jié)合；抗體與細胞蛋白、碳水化合物和脂類的非特異性結(jié)合和。但是有很多種細胞的FC受體能結(jié)合FC段（表達DC64，CD32，CD16的細胞結(jié)合力較強），同型抗體能與FC受體結(jié)合，但是結(jié)合能力和一抗是一樣的，

抗體與細胞蛋白、碳水化合物和脂類的非特異性結(jié)合，F(xiàn)c受體阻斷劑解決不了，實際實驗中有些抗體較難找到同型抗體。而且，F(xiàn)c受體阻斷劑相對比較便宜，是比較好的選擇。

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