概述
腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, tme)是由腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞，以及相應(yīng)細(xì)胞的分泌產(chǎn)物（如細(xì)胞因子和趨化因子）和細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)中的非細(xì)胞成分組成的。腫瘤微環(huán)境為腫瘤提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，這也是臨床中導(dǎo)致許多個(gè)體患者常規(guī)治療失敗的原因。腫瘤類器官相對(duì)于pdx動(dòng)物模型，體外培養(yǎng)環(huán)境相對(duì)單純，而缺乏腫瘤微環(huán)境的類器官模型，又很難wan全模擬腫瘤對(duì)于藥物的反應(yīng)性，特別是免疫細(xì)胞隨著腫瘤類器官的培養(yǎng)，會(huì)逐漸功能下降、數(shù)量減少，甚至于逐漸消失。
目前類器官的培養(yǎng)方法是機(jī)械破碎法，使用彈力剪將腫瘤組織剪成1mm3的碎片，加入培養(yǎng)液，在水平搖床上震蕩培養(yǎng)。研究結(jié)果證明，隨著類器官的培養(yǎng)腫瘤免疫細(xì)胞會(huì)大量的損失，腫瘤免疫微環(huán)境受到了很大的破壞。有文獻(xiàn)報(bào)道采用氣液交互法(air-liquid interface, ali)培養(yǎng)組織來源的類器官，可以在一定程度上保留組織原位的免疫微環(huán)境。今天，給大家介紹采用ALI方法培養(yǎng)類器官的方法。
培養(yǎng)方法
原代
一、準(zhǔn)備工作
1、儀器設(shè)備
CO2培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺(tái)、倒置顯微鏡、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、水浴鍋(abs72023)或水浴搖床，醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科鑷。
2、試劑耗材（以肺癌為例）
人肺癌類器官培養(yǎng)試劑盒(abs9443)、基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）(abs9495)、60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(abs7005)、100μm濾篩(abs7009)、15mL離心管（尖底，無菌無酶）(abs7120)、1.5mL EP管若干(abs7119)、細(xì)胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)、金屬冰盒(abs7289)、眼科剪刀、眼科鑷。
人肺癌類器官培養(yǎng)試劑盒(abs9443)
基質(zhì)膠（低因子，無酚紅）(abs9495)
組分名稱 | 規(guī)格 |
人肺癌類器官培養(yǎng)基A | 100mL |
類器官原代培養(yǎng)緩沖液B | 250mL |
人肺癌原代組織消化液C | 30mL |
類器官傳代消化液D | 30mL |
組織保存液E | 100mL |
類器官凍存液F | 20mL |
類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G | 250mL |
二、操作步驟
1、細(xì)胞小室底層凝膠基質(zhì)的制備
（1）基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；
（2）槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；
（3）融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。
低溫金屬冰盒(abs7289)
（4）在細(xì)胞培養(yǎng)超級(jí)凈臺(tái)中，用100uL槍頭吸取50uL基質(zhì)膠加入細(xì)胞小室（注意鋪展均勻），將小室放入24孔板，將孔板放入培養(yǎng)箱，靜置40-60min直到基質(zhì)膠凝固為止。
2、樣本準(zhǔn)備
（1）將組織放入含有預(yù)冷的（2-8°C）組織保存液E的取樣瓶中（浸沒整個(gè)組織），4℃從醫(yī)院/實(shí)驗(yàn)室取回；
（2）將取樣瓶消毒，組織取出放入培養(yǎng)皿樣本拍照，并登記，大小，顏色，軟硬程度，組織類型等信息。
3、清洗-剪碎
在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(abs7005)里用2-3mL原代培養(yǎng)緩沖液B浸泡。用原代培養(yǎng)緩沖液B清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后剪碎，剪成大約1-3mm3的組織塊，轉(zhuǎn)移至15mL離心管。
4、消化-過濾
（1）向15mL離心管中加入5倍原代組織消化液C（消化液體積：組織體積=5:1，如果估量組織體積困難，使用5mL消化液通常足夠）在4℃進(jìn)行消化15-30min（消化過程中隨時(shí)觀察消化情況）。
（2）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的細(xì)胞團(tuán)（5-50個(gè)細(xì)胞抱團(tuán)）后， 加入3倍體積原代培養(yǎng)緩沖液B （緩沖液體積：消化液體積=3:1）終止消化，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁。
（3）使用100μm濾篩(abs7009)進(jìn)行過濾，取少量濾液在鏡下進(jìn)行觀察。將濾液收集到15mL離心管，于300g 4℃ 富集離心5min后移去上清。
5、加膠-點(diǎn)板-加液（這里是整個(gè)原代操作的點(diǎn)睛之筆）
（1）準(zhǔn)備工作
a. 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；
b. 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；
c. 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。
（2）接種要求
細(xì)胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)，每個(gè)細(xì)胞小室孔加入50uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物。
（3）接種密度
密度建議1：基質(zhì)膠體積：細(xì)胞團(tuán)沉淀體積=25:1（如果估摸細(xì)胞團(tuán)沉淀體積困難，通常加300uL基質(zhì)膠足夠）
密度建議2：1000個(gè)細(xì)胞團(tuán)/50uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）
（4）加膠-點(diǎn)板
向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），向每個(gè)鋪了基質(zhì)凝膠的小室內(nèi)加入50uL細(xì)胞團(tuán)基質(zhì)膠混懸物，（整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行，操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性）。將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠。
（5）加液
含組織的上層凝膠凝固以后，將24孔板放入超凈臺(tái)，向下培養(yǎng)孔加入適量類器官培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的水平面不得超過上面的細(xì)胞凝膠層（如下圖），這樣就可以形成ALI微環(huán)境。
（6）將培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱，每2天換一次液，大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在100um以上，可進(jìn)行傳代操作。
傳代（消化分兩種情況）
一、細(xì)胞小室底層凝膠基質(zhì)的制備
1、基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；
2、槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；
3、融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完；
4、在細(xì)胞培養(yǎng)超級(jí)凈臺(tái)中，用100uL槍頭吸取50uL基質(zhì)膠加入細(xì)胞小室（注意鋪展均勻），將小室放入24孔板，將孔板放入培養(yǎng)箱，靜置40-60min直到基質(zhì)膠凝固為止。
二、類器官數(shù)量較多或體積較大傳代步驟
1、類器官收集及洗滌
（1）收集：用移液器吸去外培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基，向每個(gè)細(xì)胞小室添加1mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠和類器官，收集在15mL離心管中（24孔板，每5個(gè)細(xì)胞小室孔為一組）。
（2）洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。
（3）接下來將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：
第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。
第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可。
促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：
a. 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；
b. 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過10min）。
2、類器官消化
（1）添加2-3mL類器官傳代消化液D于超凈臺(tái)內(nèi)消化2-3min，消化期間吹打1-2次。此步驟以消化成細(xì)胞團(tuán)為主，千萬不要消化成單細(xì)胞，單細(xì)胞類器官存活率低。如果不確定是否消化適宜，可吸取數(shù)微升鏡下觀察，如果有較多細(xì)胞團(tuán)可停止消化。
（2）添加5倍類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化，300g 4℃離心5min棄去上清（如果有基質(zhì)膠殘留，殘留量<50uL正常，不影響傳代類器官增殖）
3、加膠-點(diǎn)板-加液
（1）準(zhǔn)備工作
a. 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；
b. 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；
c. 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。
（2）接種要求
細(xì)胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)，每個(gè)細(xì)胞小室孔加入50uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物。
（3）接種密度
密度建議1： 類器官通常按1:2傳代，例如，細(xì)胞小室收集5孔，傳代10孔，需要的基質(zhì)膠量50*10=500uL；
密度建議2：1000個(gè)細(xì)胞團(tuán)/50uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）；
注意：不管是按密度建議1還是，密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍。
（4）加膠-點(diǎn)板
向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），向每個(gè)鋪了基質(zhì)凝膠的小室內(nèi)加入50uL細(xì)胞團(tuán)基質(zhì)膠混懸物，（整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行，操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性）。將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠。
（5）加液
含組織的上層凝膠凝固以后，將24孔板放入超凈臺(tái)，向下培養(yǎng)孔加入適量類器官培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的水平面不得超過上面的細(xì)胞凝膠層，這樣就可以形成ALI微環(huán)境。
（6）將培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱，每2天換一次液，大概7-10天，多數(shù)類器官直徑在100um以上，可進(jìn)行傳代操作。
三、類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí)：
1、類器官收集、吹打、洗滌
（1）收集：用移液器吸去下培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基，向每個(gè)細(xì)胞小室添加1mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠和類器官，轉(zhuǎn)移到下培養(yǎng)孔。
（2）進(jìn)行吹打，將類器官吹成細(xì)胞團(tuán)（可取樣鏡下觀察有較多細(xì)胞團(tuán)時(shí)可停止吹打）；
（3）洗滌：24孔板，每5孔為一組，收集在15mL離心管中，加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。
（4）接下來將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：
第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留細(xì)胞團(tuán)沉淀即可。
第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸液，保留下2/3即可。
促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：
a. 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；
b. 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過10min）。
2、加膠-點(diǎn)板-加液
（1）準(zhǔn)備工作
a. 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；
b. 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；
c. 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。
（2）接種要求
細(xì)胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)，每個(gè)細(xì)胞小室孔加入50uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物。
（3）接種密度
密度建議1： 對(duì)于類器官數(shù)量較少的情況，為了維持生長(zhǎng)所需的旁分泌信號(hào)，需要2-3孔富集到1孔，例如，24孔板收集6孔，2孔富集1孔，鋪3孔，需要的基質(zhì)膠量50*3=150uL。
密度建議2：1000個(gè)細(xì)胞團(tuán)/50uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）
注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍
（4）加膠-點(diǎn)板
向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），向每個(gè)鋪了基質(zhì)凝膠的小室內(nèi)加入50uL細(xì)胞團(tuán)基質(zhì)膠混懸物，（整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行，操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性）。將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠。
（5）加液
含組織的上層凝膠凝固以后，將24孔板放入超凈臺(tái)，向下培養(yǎng)孔加入適量類器官培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的水平面不得超過上面的細(xì)胞凝膠層，這樣就可以形成ALI微環(huán)境。
（6）將培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱，每2天換一次液，大概7-10天，多數(shù)類器官直徑在100um以上，可進(jìn)行傳代操作。
凍存
凍存要領(lǐng)：
類器官不需要消化（消化后的類器官?gòu)?fù)蘇活率低）；
在類器官指數(shù)增長(zhǎng)期凍存（等到該傳代的時(shí)候類器官活性比指數(shù)期差），也就傳代后的Day3-Day4，多數(shù)類器官直徑在100um-200um，這個(gè)時(shí)機(jī)選擇凍存。
一、類器官收集及洗滌
1、收集：用移液器吸去下培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基，向每個(gè)細(xì)胞小室添加1mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠和類器官，收集在15mL離心管中（24孔板，每5個(gè)細(xì)胞小室孔為一組）。
2、洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。
3、接下來將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：
第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。
第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可。
促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：
a. 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；
b. 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過10min）。
二、類器官凍存
1、凍存密度，以細(xì)胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)為例
密度建議1：2個(gè)細(xì)胞小室孔/mL凍存液
密度建議2：500個(gè)類器官/mL凍存液（如果想計(jì)數(shù)凍存，可以參照此密度建議）
2、添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸，建議立即進(jìn)行凍存。（放置太久，DMSO對(duì)類器官有損傷）
3、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。
手動(dòng)凍存：4℃冰箱放置30min，轉(zhuǎn)移至-20℃放置1h，然后移至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。
復(fù)蘇
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1、將水浴鍋預(yù)熱至37℃；
2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用預(yù)防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面；
3、在超凈工作臺(tái)中按次序擺好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)板等。
二、細(xì)胞小室底層凝膠基質(zhì)的制備
1、基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；
2、槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；
3、融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完；
4、在細(xì)胞培養(yǎng)超級(jí)凈臺(tái)中，用100uL槍頭吸取50uL基質(zhì)膠加入細(xì)胞小室（注意鋪展均勻），將小室放入24孔板，將孔板放入培養(yǎng)箱，靜置40-60min直到基質(zhì)膠凝固為止。
三、取出凍存管
1、根據(jù)類器官凍存記錄按標(biāo)簽找到所需類器官的編號(hào)；
2、從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時(shí)核對(duì)凍存管外的編號(hào)。
四、迅速解凍
1、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地?fù)u動(dòng)，使管中地液體迅速融化；
2、約1-2min后凍存管內(nèi)液體wan全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。
五、將類器官凍存液移入15mL離心管，添加10倍體積類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃離心5min，棄上清。
六、加膠-點(diǎn)板-加液
1、準(zhǔn)備工作
（1）基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；
（2）槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；
（3）融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。
2、復(fù)蘇要求
細(xì)胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)，每個(gè)細(xì)胞小室孔加入50uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物。
3、復(fù)蘇密度
復(fù)蘇密度建議1：1:1接種（原來凍了幾個(gè)細(xì)胞小室孔就復(fù)蘇幾個(gè)細(xì)胞小室孔）；
復(fù)蘇密度建議2：500個(gè)類器官/50uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）
4、加膠-點(diǎn)板
向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），向每個(gè)鋪了基質(zhì)凝膠的小室內(nèi)加入50uL細(xì)胞團(tuán)基質(zhì)膠混懸物，（整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行，操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性）。將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠。
5、加液
含組織的上層凝膠凝固以后，將24孔板放入超凈臺(tái)，向下培養(yǎng)孔加入適量類器官培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的水平面不得超過上面的細(xì)胞凝膠層，這樣就可以形成ALI微環(huán)境。
6、培養(yǎng)
將培養(yǎng)板放于培養(yǎng)箱，每2天換一次液，大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在100um以上，可進(jìn)行傳代操作。
今天講解就到這了，大家如有實(shí)驗(yàn)問題，歡迎公眾號(hào)“愛必信生物"后臺(tái)交流哦！
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