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在之前的文章中，小愛為大家介紹了IHC的原理以及樣本處理的實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)：答應(yīng)我，看完再做IHC（上）今天我們繼續(xù)看看接下來的實(shí)驗(yàn)流程及操作要點(diǎn)。首先還是先來回顧一下IHC的整體流程：

前期樣品處理的過程包括載玻片的制備，脫蠟/復(fù)水，抗原修復(fù)（上期內(nèi)容），然后我們需要做樣品的封閉，孵育一抗和二抗，以及底物檢測(cè)，最后的處理步驟包括脫水，封片和觀察。PART1我們介紹了樣品制備環(huán)節(jié)，今天我們繼續(xù)看下PART2抗體孵育及檢測(cè)。

PART2 抗體孵育及檢測(cè)

（1）淬滅：如果使用基于酶或者生物素的檢測(cè)系統(tǒng)，樣本中內(nèi)源性酶的活性（過氧化物酶/堿性磷酸酶）或者內(nèi)源性生物素會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生非特異性干擾，因此在血清封閉之前需要先對(duì)樣品進(jìn)行淬滅。根據(jù)使用的二抗偶聯(lián)標(biāo)記不同，使用對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性封閉液進(jìn)行淬滅。

小技巧：使用免疫組化筆在樣本周圍畫圈建立疏水隔離區(qū)，可以避免樣品間的交叉染色和節(jié)約血清和抗體的用量。
 

操作步驟：將組織切片畫上阻水圈，每切片加100μL（用量以浸沒樣本區(qū)域?yàn)闇?zhǔn)，可靈活調(diào)節(jié)） 3% H2O2，室溫下孵育10min，PBST浸洗3min×3次。

（2）封閉：使用血清對(duì)樣品中非特異性結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉。一般建議在TBST/PBST中加入5%的山羊血清作為封閉液。

需要注意如果使用酪蛋白封閉液（例如牛奶），可能會(huì)影響磷酸化抗體的識(shí)別。

操作步驟：每張切片加100μL（用量以浸沒樣本區(qū)域?yàn)闇?zhǔn)，可靈活調(diào)節(jié)）5%山羊血清封閉液，室溫孵育30min。

（3）孵育一抗：抗體孵育可以選擇直標(biāo)一抗的方式或者無標(biāo)記的一抗再偶聯(lián)HRP標(biāo)記的二抗。間接檢測(cè)的方式可以進(jìn)行信號(hào)放大，靈敏度更高，是更為常規(guī)的檢測(cè)方式。一抗用于與樣品中的靶標(biāo)抗原進(jìn)行特異性結(jié)合。

在選擇IHC一抗的時(shí)候應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

1、一抗的反應(yīng)種屬：一抗的反應(yīng)種屬應(yīng)與樣品的種屬一致，并且一抗的宿主來源不同于樣品種屬。例如：如果樣品是小鼠的腫瘤，應(yīng)選擇針對(duì)于小鼠的抗體；

2、一抗的特異性：抗體的特異性不好，容易引起非特異性染色，單克隆抗體的特異性優(yōu)于多克隆抗體。標(biāo)記mAb的一般是指單克隆抗體；

3、查看抗體說明：查看抗體說明書上面的應(yīng)用，注意有些抗體僅適用于IHC-P而不適用于IHC-F，根據(jù)樣本類型進(jìn)行選擇；例如下面這個(gè)抗體可以適用于IHC-P。

操作步驟：在樣品處加入稀釋后的目的蛋白抗體，置入4℃冰箱內(nèi)過夜，PBST浸洗3min×3次。

（4）孵育二抗：二抗與一抗結(jié)合，并帶有偶聯(lián)標(biāo)記。

在選擇IHC二抗的時(shí)候應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

a. 二抗的反應(yīng)種屬應(yīng)與一抗的宿主來源相同；

b. 多標(biāo)IHC/IF實(shí)驗(yàn)中，建議優(yōu)先選擇經(jīng)過預(yù)吸附處理的二抗，可以避免不同物種間抗體的交叉反應(yīng)；

c. 某些細(xì)胞和組織（巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞，淋巴結(jié)組織，脾臟組織等）表面內(nèi)源性的Fc端受體過多，建議使用F(ab')?形式的二抗以避免其與樣品Fc受體非特異性結(jié)合。

操作步驟：在樣品上添加對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1h，PBST浸洗3min×3次。

（5）底物檢測(cè)：IHC通過酶和底物反應(yīng)在抗體結(jié)合處顯色以檢測(cè)抗原表達(dá)。顯色檢測(cè)中需要根據(jù)抗體上的偶聯(lián)標(biāo)記來選擇對(duì)應(yīng)的底物，常見的偶聯(lián)標(biāo)記有HRP和AP。二抗上帶有HRP標(biāo)記時(shí)，一般選擇DAB作為底物進(jìn)行檢測(cè)。

操作步驟：配制即用型DAB工作液，滴加新鮮配制的DAB工作液到切片上，wan全覆蓋標(biāo)本。通常顯色1-10min，DAB顯色時(shí)間需要鏡下控制，選擇最佳顯色時(shí)間，做好防護(hù)。自來水沖洗終止DAB顯色反應(yīng)。

（6）蘇木素復(fù)染：蘇木素經(jīng)氧化后生成蘇木精，是一種堿性染料，組織學(xué)中用于細(xì)胞核的染色，染色后的細(xì)胞核呈鮮明的藍(lán)色或藍(lán)紫色，可以更方便的查看細(xì)胞形態(tài)。

操作步驟：滴加適量蘇木素以覆蓋整個(gè)組織，復(fù)染 30sec~3min。用自來水wan全沖洗掉復(fù)染液。酸酒精（在100ml 70%乙醇中加入1ml鹽酸）分化3-5sec后水洗30sec，終止反應(yīng)。去離子水沖洗切片 3~5min，使胞核返藍(lán)。

明星產(chǎn)品：免疫組化二抗試劑盒（abs957）

二抗檢測(cè)試劑盒用于IHC實(shí)驗(yàn)，包含經(jīng)過條件摸索和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的最佳搭配試劑和實(shí)驗(yàn)方案，試劑盒中包含淬滅劑，封閉液，一抗放大劑，酶標(biāo)二抗聚合物和顯色底物。由于IHC實(shí)驗(yàn)一般信號(hào)較弱，需要信號(hào)放大，建議使用二抗檢測(cè)試劑盒。

1、減少一抗用量，一抗可再稀釋2-4倍；

2、Polymer酶標(biāo)二抗檢測(cè)系統(tǒng)，更低背景；

3、快速便捷，更短孵育時(shí)間，鼠兔通用；

4、單品文獻(xiàn)100+，認(rèn)可度高。

PART 3 封片和觀察

（1）脫水：80%、95%、100%、100%酒精，每步5min、二甲苯5min、重復(fù)兩次。

（2）中性樹脂封片：在玻片上滴加一滴中性樹脂，從側(cè)邊緩緩蓋上蓋玻片，動(dòng)作應(yīng)盡量緩慢，以防止產(chǎn)生氣泡。

IHC常見問題

【高背景】

1、封閉問題

封閉不好是最常見的導(dǎo)致高背景的原因，切記要注意以下幾個(gè)方面：首先封閉液的濃度我們可以適當(dāng)增加，并延長(zhǎng)封閉時(shí)間，來達(dá)到更好的封閉效果；其次容易忽略的是我們通常采用稀釋的動(dòng)物血清作為封閉液，這時(shí)就要注意血清的種屬，最好使用與二抗同種屬來源，切記不可使用與一抗同種屬來源。

2、抗體濃度

有時(shí)一抗的濃度太高會(huì)導(dǎo)致較高的背景，因此我們可以在原有一抗?jié)舛鹊幕A(chǔ)上提高稀釋度，并減少抗體孵育的時(shí)間，來達(dá)到降低背景的目的。當(dāng)然這也和抗體的效價(jià)有關(guān)，記得認(rèn)真查看抗體廠家的建議稀釋比。

3、內(nèi)源性物質(zhì)影響

常見的為內(nèi)源過氧化物酶和內(nèi)源生物素，記得要使用H2O2和Avidin來進(jìn)行封閉處理（abs9333和abs9335）。

【信號(hào)弱】

1、抗體影響

廠家在生產(chǎn)抗體的時(shí)候會(huì)做抗體應(yīng)用檢測(cè)，記得查看自己的抗體是否能運(yùn)用于IHC；其次，抗體的效價(jià)較弱，這是我們可以通過提高抗體濃度來增強(qiáng)結(jié)果的信號(hào)；最后，大家切記在保存熒光二抗的時(shí)候要避光。

2、樣本保存

應(yīng)選擇新鮮組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品取出后應(yīng)盡快放入固定液中。固定液現(xiàn)用現(xiàn)配。

3、樣本個(gè)體差異
從Uniprot或者Atlas網(wǎng)站上查看蛋白的定位，修飾等信息，并查詢蛋白在不同種屬和組織間的表達(dá)情況?；蛘呖梢韵仁褂闷渌椒ǎㄈ鏦B，F(xiàn)low等）對(duì)樣品先進(jìn)行篩選或設(shè)立陽性對(duì)照。

【樣本形態(tài)不好】

1、掉片問題

如果出現(xiàn)樣本切片掉片問題，記得使用多聚賴氨酸（abs9170）處理過的玻片，可以有效防脫。另外石蠟切片要注意烤片的溫度和時(shí)間，以60℃，2-4個(gè)小時(shí)為最佳。

2、固定問題

固定時(shí)一定要保證固定的時(shí)間和固定液（abs9179）的體積，固定時(shí)間至少在8小時(shí)以上，同時(shí)固定液的體積至少要是組織塊的20倍左右。

3、抗原修復(fù)問題

抗原修復(fù)不要使用太過劇烈的條件，尤其是對(duì)于一些硬質(zhì)組織樣本，本身比較容易脫片?？梢赃m當(dāng)摸索下修復(fù)時(shí)間。

常用熱賣貨號(hào)

Absin產(chǎn)品線：

爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè))；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...