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長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200個核苷酸的RNA分子，通常不編碼蛋白，而是以RNA的形式在表觀遺傳調(diào)控、細胞周期調(diào)控和細胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用，成為遺傳學研究熱點。

圖1 LncRNAs作用機制

一般來說，非編碼RNA功能研究的主線包含3個主要步驟：

高通量篩選：對收集的樣本進行分組，采用高通量測序技術(shù)（如RNA-Seq）和相應(yīng)的特異性數(shù)據(jù)庫進行高通量篩選，通過對轉(zhuǎn)錄本編碼潛能進行篩選，判斷其是否具有編碼潛能，從而可以判定該轉(zhuǎn)錄本是否為lncRNA。

候選lncRNA的確定：識別不同樣品（或樣品組）之間顯著差異表達的基因或lncRNA，以獲取差異表達的候選RNA。在測序得到的非編碼RNA中，通常優(yōu)先選擇差異倍數(shù)大、表達水平高、且與研究方向相關(guān)的。

功能分析與驗證：基于生物信息學預(yù)測，設(shè)計實驗來驗證非編碼RNA的生物學功能。比如通過實時定量PCR、原位雜交等技術(shù)，驗證RNA在特定樣本或條件下的表達情況。還可以通過基因敲除/敲減（如使用siRNA、shRNA或CRISPR/Cas9技術(shù)來降低lncRNA的表達水平）或者過表達實驗（如通過構(gòu)建過表達載體提高lncRNA的表達水平）等觀察表型變化。要想進行深層次的挖掘，可以研究其作用機制，RNA pull down、RIP、雙熒光素酶等實驗技術(shù)，檢測與目標RNA相互作用的蛋白質(zhì)或RNA，進一步揭示RNA的生物學功能。然后在動物或細胞模型中驗證RNA的功能和調(diào)控機制，進一步確認其在生理和病理條件下的重要性。

圖2 LncRNA研究思路

深入了解LncRNA作用機制能夠幫助我們識別疾病的潛在機制，以便尋找新的治療靶點。特別是在藥物研發(fā)中，許多藥物是通過干擾特定的RNA-蛋白質(zhì)相互作用來實現(xiàn)其治療效果的。

RIP和RNA pull-down等實驗技術(shù)是我們深入研究RNA和蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵工具。RIP運用目標蛋白的特異性抗體分離純化與蛋白相互作用的RNA，RNA pull-down通過RNA探針捕獲與之相互作用蛋白質(zhì)。今天帶大家了解一下RIP技術(shù)，具體情況如下：

RIP技術(shù)（RNA Binding Protein lmmunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具。該技術(shù)主要是運用目標蛋白的特異性抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化對結(jié)合在復合物上的RNA進行q-PCR驗證或高通量測序分析，主要進行已知蛋白與已知RNA互作QPCR驗證、已知蛋白與未知RNA互作二代測序篩選等。

圖3 RIP技術(shù)原理

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圖4 abs50071 RNA免疫共沉淀(RIP)試劑盒IP后WB驗證圖

常見問題：

1、RIP可以分提核漿的RNA-蛋白質(zhì)復合物嗎？

理論上，可以采用能分別抽提核漿蛋白的蛋白抽提kit先分離樣本，再進行RIP實驗。但是所用kit中的試劑組分不能有RNase和DNase，以及要能與下游的抗體beads孵育兼容。

2、樣本中拉下的RNA濃度過低，如何改善？

可能的原因有：樣本量過少，考慮增加樣本初始量，另一個是裂解不充分，組織樣本未研磨充分等原因。

3、溶解曲線異常

出現(xiàn)非特異擴增或有引物二聚體等情況，需重新設(shè)計引物。

4、IP和IgG樣本Ct值沒有什么差異，是什么原因造成的？

可能由于抗體沒有富集到RNA，可更換抗體嘗試；或者IgG背景過高，可增加洗滌次數(shù)或減少免疫沉淀步驟RNA投入量。

5、如何判斷RIP實驗是否成功？

RIP后WB檢測IP組和input組檢測到目的蛋白信號即判斷RIP實驗成功。

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