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在生命的宏偉藍圖中，干細胞扮演著“萬能建筑師"的角色，它們具有自我更新和分化成多種類型細胞的能力。而人多能干細胞，作為干細胞家族中比較出色的，更是蘊含著無限可能，能夠分化為人體幾乎所有的細胞類型，包括神經(jīng)細胞。這一特性，讓科學(xué)家們看到了治療因神經(jīng)元損失或損傷導(dǎo)致的疾?。ㄈ缗两鹕　柎暮Ｄ?、脊髓損傷等）的曙光。然而，要實現(xiàn)這一目標，關(guān)鍵在于找到一種高效、穩(wěn)定且安全的方法，引導(dǎo)人多能干細胞定向分化為神經(jīng)干細胞(NSCs)，進而發(fā)育成具有特定功能的神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞。正是基于這一需求，神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基應(yīng)運而生，它如同一座精心設(shè)計的橋梁，連接著希望與挑戰(zhàn)，帶領(lǐng)我們邁向神經(jīng)再生的新紀元。

下面，小愛給大家分三大塊介紹由人多能干細胞的培養(yǎng)方法，人多能干細胞誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化方法，人神經(jīng)干細胞培養(yǎng)方法。

人多能干細胞的培養(yǎng)方法

一、實驗準備：

1、人多能干細胞培養(yǎng)基配制

（1）2-8℃解凍hPSC Medium Supplement，融化后上下晃動混勻，按實際用量進行分裝，立即使用或儲存于-20~-80℃，避免反復(fù)凍融；

（2）按1:50的比例將hPSC Medium Supplement(10mL)加入到hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均勻即成為人多能干細胞培養(yǎng)基(abs9403)。

注意：混勻后的人多能干細胞培養(yǎng)基可在2-8℃穩(wěn)定儲存2-3周，不建議使用配制已超過3周的人多能干細胞培養(yǎng)基。

（3）實驗試劑平衡：人多能干細胞培養(yǎng)基實驗前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等37℃加熱。

注意：培養(yǎng)基中含有因子，不要37℃水浴加熱。

二、操作方法（以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作）

hPSC 細胞復(fù)蘇：

1、實驗操作步驟：

1.1、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1mL/0.5mL即用型基質(zhì)膠(abs9410)，輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠wan全覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h-2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲存，并于1周內(nèi)使用。

注意：a.一支凍存的干細胞的數(shù)量在1×10⁶cells/mL左右，對應(yīng)6孔板1孔；

b.即用型基質(zhì)膠對溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2、先將2-3mL的干細胞培養(yǎng)基加入15mL離心管中備用。

1.3、解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動，使其在1-2min內(nèi)快速解凍；

注意：細胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。

1.4、離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細胞培養(yǎng)基的15mL離心管中，將15mL離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000rpm離心3min；

1.5、重懸：離心后棄上清加1mL人多能干細胞培養(yǎng)基對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。

1.6、接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細胞懸液加入到已經(jīng)包被好的6孔板中，并補全每孔2mL培養(yǎng)體系。

1.7、培養(yǎng)：接種后的6孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細胞密度以及細胞團塊大小，呈4個細胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細胞均勻分布。并置于37℃，5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細胞貼壁情況；

1.8、換液：從復(fù)蘇的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

多能干細胞(PSCs)集落

hPSC 細胞傳代：

2、實驗具體操作步驟：

2.1、清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入1mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去PBS緩沖液；

2.2、消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干細胞消化液(abs9409)使之覆蓋皿底，并置于37℃培養(yǎng)箱中2-5min；

注意：消化時間依據(jù)干細胞生長密度，消化時間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗一般建議時間2-5min。消化過程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3、吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干細胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，輕柔吹打3-5次，使皿底干細胞集落脫落，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3-5次為宜，盡量避免形成單細胞。如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正常現(xiàn)象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。

2.4、離心：1000rpm離心3min，棄上清；

2.5、接種：用干細胞培養(yǎng)基吹打細胞5-10次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補全每孔2mL的培養(yǎng)體系。

注意：吹打細胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過10次。

2.6、換液：從傳代的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

多能干細胞(PSCs)集落染色圖

hPSC 細胞凍存：

3、實驗具體操作步驟：

3.1、清洗：同2.1；

3.2、消化：同2.2；

3.3、吹打：同2.3；

3.4、離心：同2.4；

3.5、重懸：離心后棄上清，加入2mL ES/iPS細胞凍存液(abs9412)對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3-5次后，將其加入到凍存管中；

注意：凍存液即用即拿，及時放回 4℃冰箱。

3.6、記錄：在凍存管上標記凍存細胞種類、時間、操作者及細胞批次。

3.7、-80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過夜。

注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

3.8、液氮凍存：24h后將-80℃冰箱中的細胞轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存。

人多能干細胞誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化方法

誘導(dǎo)培養(yǎng)基準備 

1、將冷凍的PSC補充液在2°C至8°C下解凍過夜，或在37°C水浴中快速解凍約5min；

2、解凍后的補充液可分裝成多個相同的等份，并在-5°C至-20°C保存，以制備較小體積的完整培養(yǎng)基。不要重新冷凍解凍；

3、將小瓶輕輕倒置幾次，混合解凍后的補充液；

4、從瓶中取出20mL PSC補充液，轉(zhuǎn)移到PSC培養(yǎng)基瓶中。旋轉(zhuǎn)瓶子混合，即得500mL人多功能干細胞(PSC)誘導(dǎo)神經(jīng)干培養(yǎng)基(abs9822)，簡稱誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

5、誘導(dǎo)培養(yǎng)基可在2°C至8°C保存2周。使用前，在37°C水浴中預(yù)熱當天所需量的完整培養(yǎng)基5-10min。

PSC細胞準備 

1、按照人多能干細胞的培養(yǎng)方法—hPSC細胞復(fù)蘇步驟—1.1-1.8復(fù)蘇PSCs；

2、當PSCs達到70-80%的融合度時，去除任何分化和部分分化的克??；

3、對PSCs進行傳代操作，按照人多能干細胞的培養(yǎng)方法—hPSC細胞傳代步驟—2.1-2.4傳代；

4、從新包被的6孔板中吸除包被液，并在每孔中加入2.5mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

5、輕輕搖動含有誘導(dǎo)細胞懸液的離心管，將PSC以每孔2.5×10⁵ - 3×10⁵的細胞加入包被的6孔板中。例如，如果PSC懸液中的細胞團濃度為1×10⁶個/mL，則在每孔中加入0.25-0.3mL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

6、快速前后左右移動培養(yǎng)皿，使細胞分散在培養(yǎng)皿表面，并將其輕輕置于37°C、5% CO₂的培養(yǎng)箱中；

注意：a.傳代PSCs時，細胞應(yīng)以小團塊的形式接種，而不是單個細胞懸液。避免將PSCs作為單個細胞進行接種，因為這會導(dǎo)致細胞死亡增加；

b.您可以在分裂時將10μM ROCK抑制劑Y27632加入PSC培養(yǎng)基中過夜，以防止細胞死亡。

神經(jīng)誘導(dǎo)

1、預(yù)熱誘導(dǎo)培養(yǎng)基至室溫；

2、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第0天（PSC傳代后約24h），PSC應(yīng)達到15-25%的融合度。抽吸廢培養(yǎng)基，在6孔板的每孔中加入2.5mL預(yù)熱好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放入37°C、5% CO₂的培養(yǎng)箱中；

3、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第2天，細胞集落的形態(tài)應(yīng)該是一致的。標記所有非神經(jīng)分化克隆，如果有的話，用巴斯德玻璃移液管或移液管jian端去除這些不需要的克隆。抽吸廢培養(yǎng)基，在6孔板的每孔中加入2.5 mL預(yù)熱好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱；

4、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第4天，細胞將達到融合。任何非神經(jīng)分化的克隆都應(yīng)標記并移除。從每孔中抽吸廢培養(yǎng)基，每孔用5mL預(yù)熱的誘導(dǎo)培養(yǎng)基代替，將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱；

5、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第6天，細胞應(yīng)接近最大融合。去除任何非神經(jīng)分化克隆，在每個孔中加入5mL預(yù)熱的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱；

注意：在神經(jīng)誘導(dǎo)的第4-7天，如果細胞的顏色變?yōu)楹稚?并且有許多漂浮細胞，說明PSCs的起始密度過高。在這種情況下，每天更換培養(yǎng)基，每孔加5mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

6、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第7天，NSCs(P0)已經(jīng)準備好收獲和擴增傳代。

人神經(jīng)干細胞培養(yǎng)方法

準備神經(jīng)干細胞(NSC)擴增wan全培養(yǎng)基

1、NSC wan全培養(yǎng)基需要補充NSC補充劑、L-丙氨酰-谷氨酰胺；

2、在無菌環(huán)境中，依次將20mL NSC補充劑和5mL 200mML-丙氨酰-谷氨酰胺(abs9295)（2mM終濃度）加入到含有480mL NSC培養(yǎng)基中，此時即得神經(jīng)干細胞(NSC)擴增wan全培養(yǎng)基(abs9821)；

3、（可選）在培養(yǎng)基中加入10mL/L的抗生素（青霉素-鏈霉素）溶液。

注意：a.在所有成分的有效期限內(nèi)，在2°C至8°C的黑暗環(huán)境中儲存，可穩(wěn)定長達4周；

b.可選擇添加200μM抗壞血酸，特別是懸浮培養(yǎng)。

包被孔板

1、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1mL/0.5mL即用型基質(zhì)膠(abs9410)，輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠wan全覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h-2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲存，并于1周內(nèi)使用；

2、在使用前，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，然后加入預(yù)熱的wan全NSC培養(yǎng)基。

NSC傳代

1、當細胞密度達到90-100%的融合度時，丟棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；

2、用5mL不含鈣和鎂的預(yù)溫DPBS洗滌細胞，然后吸棄溶液；

3、在每個培養(yǎng)瓶中加入1.0mL預(yù)熱的人多能干細胞消化液(abs9409)，然后在室溫下孵育2-5min。在孵育前確保wan全覆蓋細胞；

4、用倒置顯微鏡觀察細胞是否脫離。如有必要，輕拍培養(yǎng)瓶以促進細胞脫離；

5、輕輕上下移液，使團塊分散到單個細胞懸液中；

6、加入9mL預(yù)熱好的NSC wan全培養(yǎng)基停止細胞解離反應(yīng)，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中；

7、200×g離心4min；

8、丟棄上清，然后用適量NSC wan全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀；

9、用自動細胞計數(shù)器測定總活細胞密度；

10、從每個覆蓋層培養(yǎng)瓶中除去覆蓋層溶液，然后加入5mL預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基，添加Y27632（終濃度10μM）；

11、在每個培養(yǎng)瓶中加入5×10⁴細胞/cm²（例如，1.25×10⁶細胞/T-25培養(yǎng)瓶），然后混合或旋轉(zhuǎn)細胞懸液以確保均勻分布；

12、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育。

注意：為了獲得最佳性能和細胞生長，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，用新鮮的預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基。

NSC凍存

1、準備干細胞凍存液(abs9412)；

2、按照“NSC傳代"中的步驟1至步驟7收集細胞進行冷凍保存；

3、在離心過程中，計算細胞密度為2×10⁶個活細胞/mL所需的最終體積；

注意：接下來的步驟需要半體積的室溫NSC培養(yǎng)基和半體積的凍存液。

4、丟棄上清，然后用NSC wan全培養(yǎng)基重懸細胞；

5、加入等量的凍存液，使終濃度為10%DMSO；

6、立即將細胞懸液等分放入凍存瓶中（1mL/瓶）；

7、按照標準程序（每分鐘降低1°C）在自動或手動控制速率的冷凍設(shè)備中實現(xiàn)低溫保存；

8、將冷凍細胞轉(zhuǎn)移到液氮中。

NSC復(fù)蘇

1、在37°C水浴中迅速(<2min)解凍細胞；

2、用移液管將凍存液全部移入無菌的15mL離心管中；

3、小心滴加（每秒1滴），加入4mL預(yù)熱好NSC wan全培養(yǎng)基，然后輕輕旋轉(zhuǎn)離心管混合；

4、繼續(xù)添加預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基至10mL；

5、200×g離心4min，確認細胞沉淀，丟棄上清；

6、加入5mL預(yù)熱好NSC wan全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，然后添加Y27632（終濃度10μM），再將離心管的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到包被的組織培養(yǎng)瓶中；

7、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育；

8、復(fù)蘇后24h用新鮮的預(yù)熱過的NSC wan全培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。

注意：為了恢復(fù)在NSC中生長的細胞，我們建議在初始傳代時以≥1×10⁵個細胞/cm²的密度接種細胞。

今天講解就到這了，大家如有細胞培養(yǎng)問題，歡迎一起交流哦！

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