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在當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，多重?zé)晒饷庖呓M化(mIHC)技術(shù)正變得越來越重要。這項(xiàng)技術(shù)能夠在單一組織切片上同時(shí)檢測多種蛋白質(zhì)，為我們提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具，以揭示細(xì)胞和組織內(nèi)部復(fù)雜的生物學(xué)信息。隨著多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多老師希望在自己的片子上看到更豐富的靶標(biāo)信息，意味著我們需要用到更多種熒光染料去完成染色，但由于熒光染料產(chǎn)生的信號(hào)不是單純的線性，而是呈現(xiàn)山峰狀的分布，在最高點(diǎn)信號(hào)固然最好，但在最高點(diǎn)左右的一段范圍內(nèi)都能夠捕獲到它的信號(hào)，那么相鄰的染料之間，難免會(huì)有信號(hào)的重疊，導(dǎo)致最后的結(jié)果無法被準(zhǔn)確判讀。那么如何來解決這個(gè)問題呢？

首先，我們需要選擇合適的染料，明辨激發(fā)光和發(fā)射光，且不會(huì)導(dǎo)致熒光背景增強(qiáng)，選擇相距波長較遠(yuǎn)的熒光染料是避免信號(hào)重疊的關(guān)鍵。例如，Absin提供的多色試劑盒中，四色（TSA520、TSA570、TSA650、DAPI）、五色（TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、DAPI）和七色plus（TSA480、TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、TSA770、DAPI）的染料組合，這些染料之間幾乎不會(huì)有串?dāng)_的情況。

其次，染色順序的優(yōu)化至關(guān)重要。我們建議從zui低豐度靶點(diǎn)（搭配亮度zui強(qiáng)的熒光染料）開始順序染色，以最高豐度靶點(diǎn)（搭配亮度弱的染料）結(jié)束。此外，通過增加一抗?jié)舛取⒔档蜔晒鉂舛然蚋淖兛贵w的染色順序，都可平衡各靶點(diǎn)染料的搭配。

染料搭配一般遵循“寡靶配強(qiáng)光，眾靶配弱光"的原則，意思是表達(dá)比較弱的指標(biāo)搭配熒光信號(hào)比較強(qiáng)的染料，表達(dá)相對(duì)強(qiáng)的指 標(biāo)搭配信號(hào)比較弱的染料，Absin的TSA染料波長越短熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，比如說需要染PD-1，CD8和CD3，我們手里有一個(gè)四色試劑盒（TSA520/TSA570/TSA650），通過IHC發(fā)現(xiàn)樣本中PD-1的信號(hào)很少，CD3信號(hào)非常多，其次是CD8，于是選擇TSA520搭配PD-1， TSA650搭配CD3，TSA570搭配CD8，比較合理。

接下來就是怎么安排染色先后順序：

1）劃分細(xì)胞定位，先外后內(nèi)：確定每個(gè)指標(biāo)的細(xì)胞定位，膜表達(dá)先染，胞漿或者胞核的后染（如果是指標(biāo)比較多的情況下，胞內(nèi)指標(biāo)排在比較后面，經(jīng)過前期多輪洗脫，可以不做細(xì)胞通透；如果指標(biāo)很少，染胞內(nèi)指標(biāo)之前還是需要打孔，多個(gè)胞內(nèi)指標(biāo)也只需要打一次孔）；

2）確定抗原修復(fù)方式，先酸后堿：堿修復(fù)比酸修復(fù)的力度會(huì)更強(qiáng)，個(gè)別抗體在用堿修復(fù)以后會(huì)染出來很多非特異性，所以如果是相同的細(xì)胞定位，就先染酸修復(fù)，再染堿修復(fù)的抗體；

3）根據(jù)IHC結(jié)果判別，先弱后強(qiáng)：組化結(jié)果顯示指標(biāo)比較少，比較弱的，排在前面染，理論上來說越靠前染的指標(biāo)效果會(huì)越接近單標(biāo)染色；

4) 根據(jù)抗原指標(biāo)的類型判斷：一抗種類（洗脫難度：結(jié)構(gòu)性膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白 > 胞漿蛋白 > 胞核蛋白）；除非有些抗體如E-cadherin（鈣粘附蛋白E）、EpCAM（上皮細(xì)胞粘附分子）、Tuj1（β-III微管蛋白）與抗原結(jié)合十分牢固或者洗脫有問題，可降低一抗?jié)舛龋?增加洗脫時(shí)間或?qū)⑦@些抗體放到TSA標(biāo)記的最后一輪做在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，我們還需要考慮抗體的特異性和交叉反應(yīng)性。使用經(jīng)過高度驗(yàn)證的抗體，確保得到可靠的結(jié)果。通常而言，經(jīng)過IHC-P驗(yàn)證的抗體，同樣也能在mIHC中使用，但需要再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)步驟優(yōu)化。

此外，我們愛必信的多色技術(shù)采用了酪胺信號(hào)放大(TSA)技術(shù)，這允許我們在一張組織切片上實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)蛋白的共染色，最多可同時(shí)標(biāo)記數(shù)十種蛋白。TSA技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢在于可以使用同一物種的多種一抗，而無需擔(dān)心會(huì)發(fā)生交互作用，這大大簡化了多重檢測設(shè)計(jì)過程。

染色順利做完后怎么能少的了分析呢？目前市面上數(shù)據(jù)分析軟件還是比較多的，像免費(fèi)的您可以下載imageJ、Qupath，缺點(diǎn)就是用法都需要您自行摸索；我們公司安裝的是HALO和StrataQuest兩款軟件。從功能、分析的精準(zhǔn)度和可操作性來說，肯定是大大優(yōu)于開源軟件的，且有軟件專業(yè)的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)能夠答疑解惑。您可以根據(jù)您的實(shí)際情況選擇合適的分析軟件，如果您實(shí)在無從下手，也可以找Absin，我們可以提供數(shù)據(jù)分析的服務(wù)~

HALO分析（可以做單細(xì)胞層面和空間分析）；單細(xì)胞水平分析包括：單細(xì)胞總細(xì)胞計(jì)數(shù)（染核）；單（多）陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)、百分比、平均強(qiáng)度；空間水平分析包括：計(jì)算任意兩個(gè)細(xì)胞之間的平均距離、最近的細(xì)胞的鄰近度或滲透分析，數(shù)據(jù)分析結(jié)果以EXCEL形式/直方圖交付。

StrataQuest是我們TG的掃描儀平臺(tái)自帶的（基本所有的病理領(lǐng)域的分析需求都能滿足，可以出組織流式散點(diǎn)圖，直方圖），如下是StrataQuest分析軟件直出的散點(diǎn)圖和直方圖。

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