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從零開(kāi)始-細(xì)胞培養(yǎng)入門指南

閱讀:668      發(fā)布時(shí)間:2024-9-19
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細(xì)胞是生命的基本單位,是生物學(xué)研究中非常有用的工具。細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程就是人工模擬細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境,置于無(wú)菌、適宜溫度及酸堿度的環(huán)境中,保證充足的營(yíng)養(yǎng)使其不斷生長(zhǎng)繁殖,并維持其結(jié)構(gòu)和功能。作為基礎(chǔ)又常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技能,自然頗受關(guān)注。后續(xù)會(huì)創(chuàng)建《常見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)攻略》系列,會(huì)為大家介紹一些常見(jiàn)細(xì)胞的培養(yǎng)方案,包括但不限于T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、干細(xì)胞培養(yǎng)等。今天主要是細(xì)胞培養(yǎng)入門指南的相關(guān)內(nèi)容,其他的內(nèi)容大家可以持續(xù)關(guān)注追更。


1. 細(xì)胞類型

 

1) 原代細(xì)胞(primary cell):是指從機(jī)體的組織經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得單個(gè)細(xì)胞并在體外進(jìn)行模擬機(jī)體培養(yǎng)的細(xì)胞,稱為原代細(xì)胞。一般認(rèn)為,培養(yǎng)的原代的第1代細(xì)胞和傳代到第10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。

2) 細(xì)胞系(cell line):原代細(xì)胞經(jīng)初次傳代成功后即為細(xì)胞系,由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。其中能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系,不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細(xì)胞系。

3) 細(xì)胞株(cell strain):是通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)細(xì)胞中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞稱為細(xì)胞株。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。

 

圖1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的步驟(General Procedure for Cell Culture)

 

2. 培養(yǎng)體系

 

1) 培養(yǎng)體系的選擇:主要分為含血清的經(jīng)典培養(yǎng)體系和無(wú)血清培養(yǎng)體系。簡(jiǎn)單、細(xì)胞種類、小規(guī)模選擇含血清培養(yǎng)體系;長(zhǎng)周期、強(qiáng)掌控、追求細(xì)胞質(zhì)量可選擇無(wú)血清培養(yǎng)體系。

 

表1 含血清和無(wú)血清培養(yǎng)體系的區(qū)別圖(圖片源于優(yōu)寧維)

 

2) 血清的選擇:分為胎牛血清、新生牛血清、小牛血清;其中胎牛血清的普適性較好。血清主要為細(xì)胞提供基本的營(yíng)養(yǎng);血清中的微量元素可參與細(xì)胞的解毒代謝;血清中的抗蛋白酶成分也可以起到中和保護(hù)細(xì)胞的作用。小伙伴們想要了解更多血清信息,可以查看《細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題之血清篇》。當(dāng)然,具體細(xì)胞使用何種血清可以參考相關(guān)文獻(xiàn)或者實(shí)驗(yàn)組的經(jīng)驗(yàn)。

 

表2 不同血清的區(qū)別圖(圖片源于優(yōu)寧維)

 

3) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇:根據(jù)培養(yǎng)基的來(lái)源和組成成分,分為天然培養(yǎng)基(組織提取液)、合成培養(yǎng)基(經(jīng)典液體培養(yǎng)基如1640、DMEM等)、無(wú)血清培養(yǎng)基(如Lonza的X-VIXO系列培養(yǎng)基)。目前合成培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基使用居多。同樣,具體細(xì)胞使用何種培養(yǎng)基也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)或者實(shí)驗(yàn)組的經(jīng)驗(yàn)。

4) 抗生素:目前實(shí)驗(yàn)室會(huì)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加雙抗(青霉素-鏈霉素)或者三抗(青霉素-鏈霉素-兩性霉素B)用來(lái)預(yù)防細(xì)胞污染,但是對(duì)于長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)并不建議持續(xù)使用抗生素,以防細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。

5) 培養(yǎng)基中酚紅的選擇:作為PH指示劑,酚紅是培養(yǎng)基的“???。酚紅為雌激素類似物,在進(jìn)行激素誘導(dǎo)或培養(yǎng)雌激素敏感的細(xì)胞時(shí)應(yīng)慎用,另外酚紅可能對(duì)下游的流式檢測(cè)分析帶來(lái)一定的干擾。


文中部分相關(guān)產(chǎn)品


產(chǎn)品名稱

貨號(hào)

胎牛血清(優(yōu)級(jí))

abs972-500ml

RPMI 1640培養(yǎng)基(含L-谷氨酰胺,不含HEPES,不含酚紅)

abs9275

青霉素-鏈霉素溶液(100×,雙抗)

abs9244




 

3. 細(xì)胞來(lái)源

 

1) 從有資質(zhì)的公司直接進(jìn)行購(gòu)買:比如Absin可提供全面的原代細(xì)胞及優(yōu)化后適配的培養(yǎng)基,試劑和方案;ATCC作為全球quan威的生物資源中心之一,提供原代細(xì)胞、細(xì)胞系、微生物、重組物質(zhì)等。

2) 從生物體中提取制備:如血液樣本、實(shí)體組織樣本等。

3) 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的凍存細(xì)胞復(fù)蘇獲得:細(xì)胞復(fù)蘇的步驟在基本操作里面,大家可以接著往下讀。


文中部分相關(guān)產(chǎn)品


產(chǎn)品名稱

貨號(hào)

膠原酶I型

abs47048000

膠原酶II型

abs47048001




4. 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)信息收集及物質(zhì)


 

所謂信息收集是指我們要在開(kāi)始細(xì)胞培養(yǎng)前充分全面了解我們的細(xì)胞,大家可以參考文獻(xiàn)、ATCC的或者是實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn),需要獲得的信息包括不限于以下幾個(gè)方面:

1) 細(xì)胞特性:細(xì)胞的形態(tài)、增殖速度、細(xì)胞周期、傳代頻率……

2) 生長(zhǎng)方式:貼壁or懸浮

3) 培養(yǎng)體系:含血清or無(wú)血清

4) 溫度:多數(shù)人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是36-37℃;昆蟲(chóng)細(xì)胞27℃

5) PH:多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是7.4,昆蟲(chóng)細(xì)胞系6.2

6) CO2:多數(shù)適合5-7%CO2

 

5. 細(xì)胞培養(yǎng)基本原則

 

1) 無(wú)菌意識(shí):使用無(wú)菌設(shè)備、試劑和耗材;使用個(gè)人防護(hù)裝備,避免污染;試劑如有需要可使用0.22μm的過(guò)濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾;每次操作只處理一株細(xì)胞株,以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前,超凈臺(tái)以紫外燈照射 30 分鐘滅菌,以 70 % 乙醇擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面;實(shí)驗(yàn)完畢后,將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái),以 70 % 乙醇 擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面。

2) 試劑分裝:培養(yǎng)基、血清、胰酶等試劑要養(yǎng)成分裝保存的習(xí)慣,不同的細(xì)胞即使適配的培養(yǎng)基配方相同也要另外配制分裝并做好標(biāo)記。

3) 及時(shí)保種:尤其是珍貴細(xì)胞,在細(xì)胞狀態(tài)良好的時(shí)候要及時(shí)凍存保種,以備不時(shí)之需。

 

6. 基本操作


1) 顯微鏡觀察:首先觀察細(xì)胞培養(yǎng)液的顏色(如果培養(yǎng)基中含有酚紅指示劑的話,當(dāng)培養(yǎng)液顏色變?yōu)辄S色就意味著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡),其次鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。如果細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)良好,且匯合度未達(dá)到傳代的要求,可視培養(yǎng)液顏色決定時(shí)候換液;若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好,匯合度低,需要酌情優(yōu)化培養(yǎng)條件,排除污染情況;若細(xì)胞過(guò)于密集,則需進(jìn)行傳代操作。

 

細(xì)胞匯合是指細(xì)胞在培養(yǎng)皿中附著生長(zhǎng)的過(guò)程。匯合度是指細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿的百分比,不同類型的細(xì)胞需要達(dá)到不同匯合度后才能進(jìn)行傳代。

 

圖2 顯微鏡觀察細(xì)胞流程(圖片源于優(yōu)寧維)

 

2) 細(xì)胞復(fù)蘇

 

圖3 PBMC細(xì)胞復(fù)蘇流程圖
(PBMC Thawing Protocol: How to Optimize Cell Recovery)

 

a) 37℃水浴加熱需要使用的培養(yǎng)基;

b) 從液氮中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞,盡量減少其暴露在室溫(15-25℃)的時(shí)間;

c) 在37℃水浴快速解凍細(xì)胞,將凍存管轉(zhuǎn)移到生物安全柜中,用70%乙醇或異丙醇擦拭凍存管外部;

d) 將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中,加入1mL培養(yǎng)基潤(rùn)洗凍存管,培養(yǎng)基同樣收集到50mL離心管中;

e) 向50mL離心管中補(bǔ)加15-20mL培養(yǎng)基,室溫300xg離心10分鐘;

f) 小心棄掉離心后的上清液,使用適量wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,分裝到合適的培養(yǎng)皿/瓶中,顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和狀態(tài),放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

 

3) 細(xì)胞傳代

 

圖4 細(xì)胞傳代流程圖
(Cell Plating, Media Change, and Culture Maintenance Protocol)

 

a) 顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)、匯合度以及是否污染,判斷是否進(jìn)行傳代處理;

b) 以25cm2培養(yǎng)瓶、貼壁細(xì)胞為例,棄掉培養(yǎng)基,使用無(wú)菌PBS洗滌細(xì)胞以去除抑制胰蛋白酶功能的血清;

c) 加入2ml胰酶,覆蓋細(xì)胞層,放入37℃ CO2培培養(yǎng)箱中孵育2min,期間可拿出觀察細(xì)胞消化脫落情況(注意:不同細(xì)胞使用的胰酶濃度及消化時(shí)間不同);

d) 棄掉胰酶,加入2ml wan全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞;

e) 顯微鏡下計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度分裝到培養(yǎng)瓶中,將細(xì)胞置于 37oC, 5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

 

4) 細(xì)胞凍存

 

圖5 分步凍存法流程圖

 

a) 在細(xì)胞密度達(dá)到107 cells/mL時(shí)可進(jìn)行凍存,采用分步冷凍法;

b) 懸浮細(xì)胞500 g室溫離心10 min收集細(xì)胞沉淀,貼壁細(xì)胞胰酶消化并終止后離心收集;

c) 棄上清,凍存液重懸細(xì)胞沉淀,1mL分裝并做好標(biāo)記;

d) 將凍存管放置-20℃ 1h;-80℃過(guò)夜;轉(zhuǎn)移至液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。


文中部分相關(guān)產(chǎn)品


產(chǎn)品名稱

貨號(hào)

25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(50mL,透氣蓋)

abs7011-1箱

胰蛋白酶消化液(0.25%,含酚紅)

abs47014937-100ml

細(xì)胞凍存液(含血清)

abs9473-100mL

無(wú)血清細(xì)胞凍存液(科研級(jí))

abs9417-100mL




 

Absin產(chǎn)品線:

爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè));細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...


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