在當今生物醫(yī)學研究領(lǐng)域，精準、高效地識別和追蹤目標分子是解鎖疾病機制、開發(fā)新型藥物以及推動個性化醫(yī)療的關(guān)鍵?？贵w/蛋白標記技術(shù)作為一種強大的工具，在這一過程中發(fā)揮著不可替代的作用。通過將特定的化學標簽（如熒光染料、酶或放射性同位素）與抗體或蛋白質(zhì)共價結(jié)合，研究人員能夠以更高的靈敏度和特異性對復雜生物系統(tǒng)中的目標分子進行可視化和定量分析。
常見抗體/蛋白標記技術(shù)
熒光素標記：使用熒光素如Alexa Fluor系列（AF488\AF594\AF647等）、Cy系列（Cy3\Cy5\Cy7等）、FITC等與抗體或蛋白結(jié)合，常用于流式細胞術(shù)、免疫熒光和活體成像等實驗；
酶標記：如辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)標記，通過催化底物生成有色產(chǎn)物或化學發(fā)光，用于ELISA、Western Blot、免疫組化等實驗；
生物素標記：生物素(Biotin)標記法是利用生物素與抗體或蛋白等生物大分子的氨基結(jié)合，廣泛應(yīng)用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究。
一、Alexa Fluor系列染料概述
Alexa Fluor染料是羅丹明等染料的衍生物，利用磺酸或磺酸鹽代替羅丹明等染料中的氫原子合成。主要應(yīng)用于生物研究中對組織、細胞和生物分子的標記和定位。標記抗體和蛋白的Alexa Fluor系列染料其發(fā)射光譜、激發(fā)光譜、常用的激發(fā)光和等效染料如表1所示。其中較常用的是綠色熒光探針Alexa Fluor 488。與絕大部分常用的綠色熒光探針相比，Alexa Fluor 488更加明亮，不容易熒光猝滅，背景更低。
表1 常用標記抗體/蛋白的Alexa Fluor系列染料
熒光染料 | Abs(nm) | Em(nm) | 激發(fā)光源 | 等效染料 |
Alexa Fluor 350 | 346 | 442 | UV excitation | AMCA，AMCA-X |
Alexa Fluor 405 | 402 | 421 | Blue laser excitation | Pacific blue dye |
Cascade blue dye | ||||
Alexa Fluor 430 | 434 | 540 | Blue laser excitation | Lucifer yellow |
Alexa Fluor 488 | 495 | 519 | 488 nm argon and Kr/Ar laser line | Fluorescein，Cy2 |
Alexa Fluor 532 | 531 | 554 | Frequency-doubled Nd-YAG laser | Rhodamine 6G |
Alexa Fluor 546 | 556 | 573 | Hg lamp, red filter set | Cy3, TMR |
Alexa Fluor 555 | 555 | 565 | Hg lamp & 543nm green HeNe | Cy3 |
Alexa Fluor 568 | 579 | 604 | 568nm Kr/Ar laser line | Lissamine rhodamine B |
Alexa Fluor 594 | 591 | 618 | 647nm Kr/Ar laser line | Texas red |
Alexa Fluor 647 | 650 | 665 | 647nm Kr/Ar laser line | Cy5 |
Alexa Fluor 660 | 650 | 690 | 647nm or 633nm laser lines | Cy5 |
Alexa Fluor 680 | 679 | 702 | Xenon-are or far-red diode laser | Cy5.5 |
Alexa Fluor 700 | 696 | 719 | Xenon-are or far-red diode laser | Cy5.5 |
Alexa Fluor 750 | 752 | 779 | Xenon-are or dye pumped lasers | Cy7 |
抗體/蛋白Alexa Fluor標記原理及優(yōu)勢
Alexa Fluor標記利用了高效和簡單的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯化學反應(yīng)，選擇性地將Alexa Fluor染料與鄰近蛋白質(zhì)的氨基基團（-NH2，包括賴氨酸側(cè)鏈和氨基端）相連接，共價結(jié)合形成一個穩(wěn)定的琥珀酰亞胺酯結(jié)構(gòu)（圖1）。
圖1 NHS酯反應(yīng)示意圖
R表示具有NHS酯反應(yīng)基團的標記試劑或交聯(lián)劑的一端；P表示含有伯胺(-NH2)的蛋白分子
Alexa Fluor系列染料具有以下優(yōu)勢：
①發(fā)射光譜窄。相較于傳統(tǒng)有機熒光染料，Alexa Fluor染料具有較窄的發(fā)射光譜，從而降低不同檢測的交叉水平；
②熒光強度強，光穩(wěn)定性好；
③受溫度和pH的影響較??；
④具有良好的水溶性。無需有機試劑Alexa Fluor染料即可結(jié)合蛋白質(zhì)，且儲存不易產(chǎn)生沉淀；
⑤Alexa Fluor系列染料具有不同的顏色，可根據(jù)實驗需要，用不同Alexa Fluor染料標記不同的對象，從而實現(xiàn)區(qū)分。
二、Cy系列染料概述
Cy是花菁(Cyanine)的縮寫，也叫菁染料。Cy染料性能優(yōu)良，摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是最高的。通常情況下，根據(jù)需要標記的生物分子可標記基團（如胺基、醛基或巰基）以及酸堿性，選擇相應(yīng)的活化（NHS酯、羧酸基團、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺等）染料和反應(yīng)條件 。其NHS酯是較常用的脂肪氨基標記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標記和檢測。其中菁染料Cy3和Cy5 已成為基因芯片的選擇熒光標記物；另外，Cy5、Cy5.5和Cy7的吸收在近紅外區(qū)背景非常低，是熒光強度最高、且穩(wěn)定的長波長染料，特別適合于活體小動物體內(nèi)成像代替放射性元素（圖2）。
圖2 Cy3(左)，Cy5(中)和Cy7(右)染料的最大吸光度(虛線)和發(fā)射光(陰影區(qū)域)
Cy系列染料的優(yōu)點：
①光譜窄，信號強，靈敏度高；
②染料的摩爾吸光系數(shù)高于其他熒光染料；
③染料細胞毒性小，可用于標記抗體、蛋白、細胞；
④熒光波段在近紅外區(qū)段的組織透過性好，非常適合做小鼠活體成像。
三、HRP和ALP標記概述
辣根過氧化物酶（HRP, Horseradish Peroxidase）和堿性磷酸酶（ALP, Alkaline Phosphatase）是兩種常用的酶標記，它們可以與抗體結(jié)合，用于各種免疫學檢測方法中，如ELISA、Western blotting、免疫組化等。這些酶標記的抗體能夠通過特定的底物反應(yīng)產(chǎn)生可檢測的信號，從而幫助定量或定位目標抗原。
辣根過氧化物酶（HRP）特點：HRP是一種非常穩(wěn)定的酶，在廣泛的pH范圍內(nèi)都能保持活性。它催化過氧化氫（H2O2）與某些供氫體之間的反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物或發(fā)光信號。
應(yīng)用：
①ELISA：在酶聯(lián)免疫吸附測定中，HRP標記的二抗可以用來檢測被固定在板上的抗原-一抗復合物。
②Western Blotting：HRP標記的抗體可用于識別并顯色轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)條帶。
③免疫組化：HRP標記抗體用于組織切片中的抗原定位，通過染色來觀察細胞內(nèi)的特定分子。
堿性磷酸酶（ALP）特點：ALP在堿性條件下較活躍，它能去除磷酸根基團，將無色的磷酸酯底物轉(zhuǎn)化為有顏色的產(chǎn)物。相比于HRP，ALP可能對一些底物顯示出更高的特異性和穩(wěn)定性。在某些情況下，ALP產(chǎn)生的信號比HRP更持久，這有助于提高低豐度抗原的檢測能力。
應(yīng)用：
①ELISA：類似于HRP的應(yīng)用，但通常使用不同的底物。
②免疫組化：ALP特別適合用于需要長時間染色或保存染色結(jié)果的情況。
③原位雜交：ALP也常用于核酸探針的標記，以便在細胞內(nèi)定位DNA或RNA。
四、生物素標記概述
生物素（Biotin）是一種小分子維生素，也稱為維生素H或B7。經(jīng)活化后（Biotin-NHS）可與蛋白/抗體等生物大分子的氨基結(jié)合，不僅可以很好地保持大分子的生物活性，而且與親和素結(jié)合使用時具有多級放大作用，使其廣泛應(yīng)用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究。
在進行生物素標記時，需要注意幾個關(guān)鍵點：
① 待標記物的濃度不應(yīng)過低，以確保標記效率；
② 生物素與待標記物的比例要合適，以避免影響待標記物的活性；
③ 為了減少空間位阻的影響，可以在生物素與被標記物之間加入交聯(lián)臂結(jié)構(gòu)；
④標記反應(yīng)后的純化步驟至關(guān)重要，以去除未反應(yīng)的生物素和其它雜質(zhì)。
常見問題解答
Q1：蛋白標記FITC損耗怎么樣？
A1：損失比較小，有95%以上的收率。
Q2：AF488標記抗體的原理？
A2：基于N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯的化學反應(yīng)，該反應(yīng)可以與抗體分子中的伯胺基團(-NH2)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，之后脫鹽柱去除游離的染料。
Q3：流式實驗，抗體標記推薦什么染料合適？
A3：流式實驗需要純化，不建議PE（收率只有20%左右）和APC標記（收率50%左右）可以推薦小分子熒光標記，如FITC、AF系列，Cy系列等，標記效率很高，可以滿足流式實驗。
Q4：抗體中含有50%的甘油，可以標記嗎？
A4：可以，我們會先進行透析，去除甘油后再進行標記。
Q5：生物素標記蛋白，有標記效率及COA嗎？
A5：95%以上的標記效率，呈正態(tài)分布，蛋白和生物素1:3，按照標準流程標記。COA有的，COA里包含濃度，體積和buffer信息。
Q6：標記的抗體/蛋白如何保存？
A6：無論是熒光染料偶聯(lián)抗體、酶偶聯(lián)抗體還是生物素偶聯(lián)抗體，都需要保存在深色瓶內(nèi)，或者包裹上鋁箔紙。收到產(chǎn)品后立即分裝，避免反復凍融。不要在HRP偶聯(lián)抗體中加入疊氮hua鈉，因為這種保護劑會抑制HRP的活性。短期儲存放在4℃（1-2周），如果需要長期儲存，應(yīng)加入冷凍保護劑（如甘油）后置于-20℃下保存。
Absin可以提供多種常見熒光素FITC\AF488\AF594\AF647/CY3/CY5/ CY5.5/CY7以及HRP或者生物素的標記，體系成熟，目前常規(guī)染料標記周期1-2周。
此外，我司還可提供產(chǎn)品定制和實驗服務(wù)，包括定制抗體、定制多肽、定制蛋白、定制mRNA、定制腫瘤/傳染病抗原特異性T細胞含量檢測刺激物、多重熒光免疫組化服務(wù)、ELISA服務(wù)、生化檢測服務(wù)、TR-FRET服務(wù)、標記、純化等服務(wù)。更多定制需求請聯(lián)系我們。
本期產(chǎn)品推薦：
抗體/蛋白標記試劑
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | CAS號 | 規(guī)格 |
abs47047679 | 辣根過氧化物酶(HRP) | 9003-99-0 | 5mg |
abs42018594 | 異硫氰酸熒光素酯(5-FITC) | 3326-32-7 | 500mg |
abs47048093 | 堿性磷酸酯酶(ALP) | 9001-78-9 | 1mg |
abs42235702 | 多甲藻黃素-葉綠素-蛋白復合物(PerCP) | - | 1mg |
abs45153587 | B-Phycoerythrin(B-PE) | - | 1mg |
abs45153588 | Cross Linked-Allophycocyanin(CL-APC) | - | 1mg |
流式抗體串聯(lián)染料
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | λEx(nm)/ λEm(nm) | |
abs47048236 | 串聯(lián)染料APC-Cy7 | 1mg | 651/780 | |
abs47048237 | 串聯(lián)染料PerCP-Cy5.5 | 1mg | 489/679 | |
abs47048238 | 串聯(lián)染料PE-Cy5 | 1mg | 565/670 | |
abs47048239 | 串聯(lián)染料APC-Cy5.5 | 1mg | 651/700 | |
abs47048240 | 串聯(lián)染料PE-Cy7 | 1mg | 565/780 | |
abs47048241 | 串聯(lián)染料PE-Cy5.5 | 1mg | 565/700 | |
Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
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