活性氧（ROS）是細胞代謝的副產(chǎn)物，包括超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥基自由基等。它們在細胞信號傳導(dǎo)中起作用，但過量產(chǎn)生會導(dǎo)致細胞損傷，并與多種疾病有關(guān)。目前針對ROS的檢測方法包括熒光染色法、化學(xué)發(fā)光法、電子順磁共振技術(shù)（EPR/ESR）、電化學(xué)生物傳感器、色譜法、分光光度法和基于熒光蛋白的方法（表1）。
表1 常用ROS的檢測方法
ROS檢測方法 | 方法描述 |
熒光染色法 | 使用特定的熒光探針如DCFH-DA，可以檢測多種ROS，探針本身無熒光，進入細胞后被酯酶水解生成DCFH，隨后被ROS氧化生成具有熒光的DCF |
化學(xué)發(fā)光法 | 利用某些化學(xué)物質(zhì)與ROS反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光信號來定量ROS |
電子順磁共振技術(shù)(EPR/ESR) | 直接檢測自由基的方法，適用于檢測包括羥基自由基在內(nèi)的多種ROS |
電化學(xué)生物傳感器 | 利用電化學(xué)方法檢測ROS，具有高靈敏度和選擇性 |
色譜法 | 通過色譜分離技術(shù)檢測特定的ROS或其代謝產(chǎn)物 |
分光光度法 | 使用特定的分光光度計來檢測ROS，如通過檢測硝基四唑藍(NBT)的還原來檢測超氧陰離子 |
基于熒光蛋白的方法 | 利用基因工程技術(shù)將熒光蛋白與ROS敏感的肽段融合，通過熒光變化檢測ROS |
檢測ROS水平對于理解細胞生理功能和環(huán)境因素導(dǎo)致的細胞損傷至關(guān)重要。今天小愛帶大家重點了解熒光染色法檢測細胞內(nèi)ROS的原理及具體操作步驟。
活性氧檢測攻略
一、選擇合適的探針
DCFH-DA：這是一種常用的熒光探針，通過檢測其氧化產(chǎn)物DCF的熒光強度來定量細胞內(nèi)ROS水平。DCFH-DA本身無熒光，可自由穿過細胞膜，在細胞內(nèi)被酯酶水解生成DCFH，隨后被氧化生成DCF，其熒光強度與ROS水平成正比。
圖1 DCFH-DA探針在細胞內(nèi)的作用機制[1]
二、 實驗步驟（以abs580232，活性氧ROS檢測試劑盒為例）
1、裝載ROS探針
1）原位裝載探針（僅適用于貼壁細胞）
① 細胞準備：檢測前一天進行細胞鋪板，確保檢測時細胞數(shù)量小于5×105/mL。
② 藥物誘導(dǎo)：去除細胞培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)基稀釋的藥物處理，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實際誘導(dǎo)時間由藥物特性和細胞類型決定。
③（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等稀釋陽性對照（abs580232，Rosup, 100mM）到常用工作濃度100μM，加入細胞，37℃避光孵育30min-4h，以提高活性氧水平，不同細胞類型存在差異。例如：HeLa細胞需孵育30-60min，MRC5人胚胎成纖維細胞則需孵育90min。
④ ROS探針準備：探針裝載前按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。
⑤ ROS探針裝載：吸除處理藥物，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積需充分蓋住細胞。例如：6孔板通常不少于1mL，對于96孔板通常不少于100μL。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30min。
⑥ 細胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞1-2次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。
2）收集細胞后裝載探針（適用于貼壁細胞和懸浮細胞）
① 細胞準備：按照標準方法培養(yǎng)細胞，必須保證檢測用細胞狀態(tài)。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細胞。
② 藥物誘導(dǎo)：將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實際誘導(dǎo)時間由藥物特性和細胞類型決定。
③（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基稀釋陽性對照（abs580232，Rosup, 100mM）到常用工作濃度100μM，加入細胞，37℃避光孵育30min-4h以提高活性氧水平，不同細胞類型存在差異。例如：HeLa細胞需孵育30-60min，MRC5人胚胎成纖維細胞則需孵育90min。
④ ROS探針準備：探針裝載前，按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μM。
⑤ 探針裝載：除去細胞內(nèi)藥物，離心收集細胞，加入稀釋好的探針，使其細胞密度為1.0×106-2.0×107。注意：細胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進行調(diào)整。例如：對于流式分析，單管檢測內(nèi)細胞數(shù)目不少于104，也不可多于106。
⑥ 細胞清洗：用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1-2次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。
2、熒光顯微鏡檢測
1）對貼壁生長細胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對懸浮生長細胞，取25-50μL 細胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。
2）熒光顯微鏡下，選用FITC濾光片觀察熒光，去除背景觀察熒光的變化。
3、流式細胞儀分析
1）對貼壁生長細胞，用胰酶消化制備成單細胞懸液；對懸浮生長細胞，直接收集細胞。用0.5-1mL PBS重懸細胞(0.5-1×105/mL)。
2）選擇流式細胞儀FL1或BL1通道，488nm激發(fā)，測定530nm的發(fā)射，細胞應(yīng)可分成兩個亞群：ROS陰性細胞僅有很低的熒光強度，ROS陽性細胞有較強的綠色熒光。
DCFH-DA在ROS檢測中的應(yīng)用
Gao[2]等采用標準熒光探針 2′,7′-二氯二氫代熒光黃二醋酸（abs42197174，DCFH-DA）來測定脂質(zhì)體處理后4T1細胞內(nèi)的ROS。具體操作流程如下：
1）將4T1細胞接種在35mm培養(yǎng)皿中，密度為8×104細胞/孔。
2）細胞培養(yǎng)24h匯合度達到70–80%后，將脂質(zhì)體（1mL，1mg/mL）加入培養(yǎng)基中。配方處理6h后，用PBS洗滌細胞三次。
3）用DCFH-DA（abs42197174，10μM）染色，孵育30min后，用PBS洗滌細胞三次，然后使用共聚焦激光掃描顯微鏡進行CLSM成像。
圖2 4T1細胞中的ROS成像[2]
無論脂質(zhì)體類型如何，巖藻糖工程化脂質(zhì)體在4T1細胞中產(chǎn)生的ROS都比非靶向脂質(zhì)體多（圖2），主要是因為細胞攝取增強。由于DAPC過氧化，DAPC-Fuc在ROS生成方面比DOPC-Fuc更有效。
參考文獻：
[1] Rajneesh, Pathak J, Chatterjee A, et al. Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cyanobacteria Using the Oxidant-sensing Probe 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH-DA)[J]. Bio Protoc. 2017;7(17):e2545.
[2] Gao Z, Zhang J, Hou Y, et al. Boosting the synergism between cancer ferroptosis and immunotherapy via targeted stimuli-responsive liposomes[J]. Biomaterials.2024;305:122442.
細胞ROS檢測產(chǎn)品推薦：
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
abs42197174 | 2,7-二氯二氫代熒光黃二醋酸（DCFH-DA） | 100mg |
abs580232 | 活性氧ROS檢測試劑盒（綠色熒光） | 1000T |
abs580233 | 活性氧ROS檢測試劑盒（紅色熒光） | 100-500T |
氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)品推薦：
檢測項目 | 貨號-規(guī)格 | 產(chǎn)品名稱 | 檢測方法/范圍 |
DNA的氧化產(chǎn)物 | abs122148-100uL | Rabbit anti-8-OHdG Polyclonal Antibody | IHC-P |
abs60590-75T | 彗星法DNA損傷分析試劑盒(3孔載玻片） | 核酸電泳 | |
脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 | abs580011-96T | 丙二醛(MDA)檢測試劑盒 | 比色法；0.01mmol/L-1mmol/L |
抗氧化酶 | abs580010-96T | 超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒 | 比色法；1U/mL-30U/mL |
abs580060-96T | 過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒 | 比色法；1mmol/L-100mmol/L | |
abs580136-96T | 谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒 | 比色法；0.01mmol/L-5mmol/L | |
abs580042-96T | 谷胱甘肽還原酶檢測試劑盒 | 比色法；4umol/L-400umol/L | |
abs580046-96T | 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)檢測試劑盒 | 比色法 | |
abs580041-96T | 硫氧還蛋白氧化還原酶檢測試劑盒 | 比色法 | |
非酶抗氧化劑 | abs580006-96T | 谷胱甘肽檢測試劑盒 | 比色法；0.01mmol/L-0.5mmol/L |
abs580153-96T | 維生素E檢測試劑盒 | 比色法；50umol/L-2000umol/L | |
abs580047-96T | 維生素C檢測試劑盒 | 比色法；0.02mmol/L-2mmol/L | |
abs580226-96T | 輔酶Q10檢測試劑盒 | 比色法；0.1mmol/L-10mmol/L | |
總抗氧化能力 | abs580109-96T | 總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒 | 比色法；0.04mmol/L-4mmol/L |
自由基捕獲劑 | abs42017311-1g | 5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO) | 電子自旋共振法 |
線粒體氧化損傷檢測產(chǎn)品推薦：
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
abs9103 | JC-1碘化物 | 5mg |
abs580238 | 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性檢測試劑盒(微量法) | 96T |
abs580239 | 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ活性檢測試劑盒(微量法) | 96T |
abs580240 | 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ活性檢測試劑盒(微量法) | 96T |
abs580241 | 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性檢測試劑盒(微量法) | 96T |
abs580242 | 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒(微量法) | 96T |
abs60590 | 彗星法DNA損傷分析試劑盒(3孔載玻片) | 15T |
abs50064 | 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)檢測試劑盒 | 50T |
Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
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