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人多能干細胞的培養(yǎng)方法

一、實驗準備

1、人多能干細胞培養(yǎng)基配制

（1）2-8℃解凍hPSC Medium Supplement，融化后上下晃動混勻，按實際用量進行分裝，立即使用或儲存于-20~-80℃，避免反復凍融；

（2）按1:50的比例將 hPSC Medium Supplement(10mL)加入到hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均勻即成為人多能干細胞培養(yǎng)基(abs9403)；

注意：混勻后的人多能干細胞培養(yǎng)基可在2-8℃穩(wěn)定儲存2-3周，不建議使用配制已超過3周的人多能干細胞培養(yǎng)基。

（3） 實驗試劑平衡：人多能干細胞培養(yǎng)基實驗前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等 37℃加熱。

注意：培養(yǎng)基中含有因子，不要37℃水浴加熱。

二、操作方法(以下步驟皆應在無菌條件下操作)

hPSC細胞復蘇：

1、實驗操作步驟：

1.1、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1mL/0.5mL即用型基質(zhì)膠(abs9410)，輕輕晃動6孔板/12孔板使基質(zhì)膠覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h-2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲存，并于1周內(nèi)使用。

注意：

① 一支凍存的干細胞的數(shù)量在1×10⁶cells/mL 左右，對應6孔板1孔；

② 即用型基質(zhì)膠對溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2、先將2-3mL的干細胞培養(yǎng)基加入15mL離心管中備用。

1.3、解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動，使其在1-2min內(nèi)快速解凍；

注意：細胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。

1.4、離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細胞培養(yǎng)基的15mL離心管中，將15mL離心管置于低速離心機中配比平衡后，1000rpm離心3min；

1.5、重懸：離心后棄上清加1mL人多能干細胞培養(yǎng)基對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。

1.6、接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細胞懸液加入到已經(jīng)包被好的6孔板中，并補全每孔2mL培養(yǎng)體系。

1.7、培養(yǎng)：接種后的6孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細胞密度以及細胞團塊大小，呈4個細胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細胞均勻分布。并置于37℃，5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細胞貼壁情況；

1.8、換液：從復蘇的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應及時更換新鮮培養(yǎng)基。

多能干細胞(PSCs)集落

hPSC 細胞傳代：

2、實驗具體操作步驟：

2.1、清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入1mL PBS緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去PBS緩沖液；

2.2、消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干細胞消化液(abs9409)使之覆蓋皿底，并置于37℃培養(yǎng)箱中2-5min；

注意：消化時間依據(jù)干細胞生長密度，消化時間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗一般建議時間2-5min。消化過程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3、吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干細胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，輕柔吹打3-5次，使皿底干細胞集落脫落，并將其并轉移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3-5次為宜，盡量避免形成單細胞。如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。

2.4、離心：1000rpm離心3min，棄上清；

2.5、接種：用干細胞培養(yǎng)基吹打細胞5-10次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補全每孔2mL的培養(yǎng)體系。

注意：吹打細胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過10次。

2.6、換液：從傳代的時間開始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應及時更換新鮮培養(yǎng)基。

多能干細胞(PSCs)集落染色圖

hPSC 細胞凍存：

3、實驗具體操作步驟：

3.1、清洗：同 2.1；

3.2、消化：同 2.2；

3.3、吹打：同 2.3；

3.4、離心：同 2.4；

3.5、重懸：離心后棄上清，加入2mL ES/iPS細胞凍存液(abs9412)對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3-5次后，將其加入到凍存管中；

注意：凍存液即用即拿，及時放回 4℃冰箱。

3.6、記錄：在凍存管上標記凍存細胞種類、時間、操作者及細胞批次。

3.7、-80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過夜。

注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

3.8、液氮凍存：24h后將-80℃冰箱中的細胞轉移至液氮中長期凍存。

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