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三、人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法

準(zhǔn)備神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)擴(kuò)增wan全培養(yǎng)基

1、NSCwan全培養(yǎng)基需要補(bǔ)充NSC補(bǔ)充劑、L-丙氨酰-谷氨酰胺。

2、在無菌環(huán)境中，依次將20mL NSC補(bǔ)充劑和5mL 200mML-丙氨酰-谷氨酰胺(abs9295)（2mM終濃度）加入到含有480mL NSC培養(yǎng)基中，此時(shí)即得神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)擴(kuò)增wan全培養(yǎng)基(abs9821)。

3、（可選）在培養(yǎng)基中加入10mL/L的抗生素（青霉素-鏈霉素）溶液。

注意：在所有成分的有效期限內(nèi)，在2°C至8°C的黑暗環(huán)境中儲(chǔ)存，可穩(wěn)定長達(dá)4周。

注意：可選擇添加200μM抗壞血酸，特別是懸浮培養(yǎng)。

包被孔板

1、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1mL/0.5mL即用型基質(zhì)膠(abs9410)，輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使基質(zhì)膠wan全覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h-2h，實(shí)驗(yàn)前拿出并置于超凈工作臺(tái)/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時(shí)不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲(chǔ)存，并于1周內(nèi)使用。

2、在使用前，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，然后加入預(yù)熱的wan全NSC培養(yǎng)基。

NSC傳代

1、當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90-100%的融合度時(shí)，丟棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基。

2、用5mL不含鈣和鎂的預(yù)溫DPBS洗滌細(xì)胞，然后吸棄溶液。

3、在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入1.0mL預(yù)熱的人多能干細(xì)胞消化液(abs9409)，然后在室溫下孵育2-5min。在孵育前確保wan全覆蓋細(xì)胞。

4、用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞是否脫離。如有必要，輕拍培養(yǎng)瓶以促進(jìn)細(xì)胞脫離。

5、輕輕上下移液，使團(tuán)塊分散到單個(gè)細(xì)胞懸液中。

6、加入9mL預(yù)熱好的NSC wan全培養(yǎng)基停止細(xì)胞解離反應(yīng)，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中。

7、200×g離心4min。

8、丟棄上清，然后用適量NSC wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。

9、用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定總活細(xì)胞密度。

10、從每個(gè)覆蓋層培養(yǎng)瓶中除去覆蓋層溶液，然后加入5mL預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基，添加Y27632（終濃度10μM）。

11、在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入5×10⁴細(xì)胞/cm²(例如，1.25×10⁶細(xì)胞/T-25培養(yǎng)瓶)，然后混合或旋轉(zhuǎn)細(xì)胞懸液以確保均勻分布。

12、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育。

注：為了獲得最佳性能和細(xì)胞生長，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，用新鮮的預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基。

NSC凍存

1、準(zhǔn)備干細(xì)胞凍存液(abs9412)。

2、按照“NSC傳代"中的步驟1至步驟7收集細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存。

3、在離心過程中，計(jì)算細(xì)胞密度為2×10⁶個(gè)活細(xì)胞/mL所需的最終體積。

注：接下來的步驟需要半體積的室溫NSC培養(yǎng)基和半體積的凍存液。

4、丟棄上清，然后用NSC wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

5、加入等量的凍存液，使終濃度為10%DMSO。

6、立即將細(xì)胞懸液等分放入凍存瓶中（1mL/瓶）。

7、按照標(biāo)準(zhǔn)程序（每分鐘降低1°C）在自動(dòng)或手動(dòng)控制速率的冷凍設(shè)備中實(shí)現(xiàn)低溫保存。

8、將冷凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中。

NSC復(fù)蘇

1、在37°C水浴中迅速(<2min)解凍細(xì)胞。

2、用移液管將凍存液全部移入無菌的15mL離心管中。

3、小心滴加（每秒1滴），加入4mL預(yù)熱好NSC wan全培養(yǎng)基，然后輕輕旋轉(zhuǎn)離心管混合。

4、繼續(xù)添加預(yù)熱的NSC wan全培養(yǎng)基至10mL。

5、200×g離心4min，確認(rèn)細(xì)胞沉淀，丟棄上清。

6、加入5mL預(yù)熱好NSC wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，然后添加Y27632（終濃度10μM），再將離心管的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到包被的組織培養(yǎng)瓶中。

7、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育。

8、復(fù)蘇后24h用新鮮的預(yù)熱過的NSC wan全培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。

注：為了恢復(fù)在NSC中生長的細(xì)胞，我們建議在初始傳代時(shí)以≥1×10⁵個(gè)細(xì)胞/cm²的密度接種細(xì)胞。

四、人神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)形成腦類器官

原代

一、準(zhǔn)備工作

1、儀器設(shè)備

CO₂培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺(tái)、倒置顯微鏡、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、水浴鍋(abs72023)或水浴搖床、醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）。

2、劑耗材（以腸癌為例）

動(dòng)物腦類器官培養(yǎng)基試劑盒(abs90050)、基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）(abs9495)、15mL離心管(abs7102)、1.5mL EP管若干(abs7119)、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(abs7035)、金屬冰盒。

二、操作流程

1、加膠-點(diǎn)板-加液（這里是整個(gè)原代操作的點(diǎn)睛之筆）

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

低溫金屬冰盒(abs7289)

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

干細(xì)胞團(tuán)沉淀

消化收集神經(jīng)干細(xì)胞團(tuán)到15mL離心管，于300g 4℃富集離心5min后移去上清。

密度建議1：基質(zhì)膠體積：細(xì)胞團(tuán)沉淀體積=25:1（如果估摸細(xì)胞團(tuán)沉淀體積困難，通常加300uL基質(zhì)膠足夠）

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點(diǎn)板

向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200um-500um，可進(jìn)行傳代操作。

鋪板密度

胎羊及胎鼠類器官生長圖

傳代（消化分兩種情況）

一、類器官數(shù)量較多或體積較大傳代步驟

1、類器官收集及洗滌

1）收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）。

2）洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。

3）接下來將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長（最常不超過10min）。

2、類器官消化

1）添加2-3mL類器官傳代消化液D于超凈臺(tái)內(nèi)消化2-3min，消化期間吹打1-2次。此步驟以消化成細(xì)胞團(tuán)為主，千萬不要消化成單細(xì)胞，單細(xì)胞類器官存活率低。如果不確定是否消化適宜，可吸取數(shù)微升鏡下觀察，如果有較多細(xì)胞團(tuán)可停止消化。

2）添加5倍類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化，300g 4℃離心5min棄去上清（如果有基質(zhì)膠殘留，殘留量<50uL正常，不影響傳代類器官增殖）

3、加膠-點(diǎn)板-加液

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1： 類器官通常按1:2傳代，例如，24孔板收集5孔，傳代10孔，需要的基質(zhì)膠量25*10=250uL

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是，密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點(diǎn)板

向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL人腸癌類器官培養(yǎng)基 A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200-300um，可進(jìn)行傳代操作。

二、類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí)：

1、類器官收集、吹打、洗滌

1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠。

2）進(jìn)行吹打，將類器官吹成細(xì)胞團(tuán)（可取樣鏡下觀察有較多細(xì)胞團(tuán)時(shí)可停止吹打）；

3）洗滌： 24孔板，每5孔為一組，收集在15mL離心管中，加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。

4）接下來將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留細(xì)胞團(tuán)沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸液，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長（最常不超過10min）。

2、加膠-點(diǎn)板-加液

（1）準(zhǔn)備工作

a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；

c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

密度建議1： 對(duì)于類器官數(shù)量較少的情況，為了維持生長所需的旁分泌信號(hào)，需要2-3孔富集到1孔，例如，24孔板收集6孔，2孔富集1孔，鋪3孔，需要的基質(zhì)膠量25*3=75uL

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點(diǎn)板

向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基 A進(jìn)行培養(yǎng)。大概7-10天，多數(shù)類器官直徑在200-300um，可進(jìn)行再次傳代。

凍存

凍存要領(lǐng):

類器官不需要消化（消化后的類器官復(fù)蘇活率低）；

在類器官指數(shù)增長期凍存（等到該傳代的時(shí)候類器官活性比指數(shù)期差），也就傳代后的Day3-Day4，多數(shù)類器官直徑在100um-200um，這個(gè)時(shí)機(jī)選擇凍存。

一、類器官收集及洗滌

1、收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）。

2、洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說明冷化好了）。

3、接下來將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：

a 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；

b 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長（最常不超過10min）。

二、類器官凍存

1、凍存密度，以24孔板為例

密度建議1：2孔/mL凍存液

密度建議2：500個(gè)類器官/mL凍存液（如果想計(jì)數(shù)凍存，可以參照此密度建議）

2、添加適量類器官凍存液F，輕柔吹打重懸，建議立即進(jìn)行凍存。（放置太久，DMSO對(duì)類器官有損傷）

3、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

     手動(dòng)凍存：4℃冰箱放置30min，轉(zhuǎn)移至-20℃放置1h，然后移至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

復(fù)蘇

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1、將水浴鍋預(yù)熱至37℃；

2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用預(yù)防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面；

3、在超凈工作臺(tái)中按次序擺好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)板等。

二、取出凍存管

1、根據(jù)類器官凍存記錄按標(biāo)簽找到所需類器官的編號(hào)。

2、從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時(shí)核對(duì)凍存管外的編號(hào)。

三、迅速解凍

1、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地?fù)u動(dòng)，使管中地液體迅速融化。

2、約1-2min后凍存管內(nèi)液體wan全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

四、將類器官凍存液移入15mL離心管，添加10倍體積類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃離心5min，棄上清。

五、加膠-點(diǎn)板-加液

1、準(zhǔn)備工作

（1）基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

（2）槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；

（3）融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

2、復(fù)蘇要求

24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠類器官混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

3、復(fù)蘇密度

復(fù)蘇密度建議1：1:1接種（原來凍幾孔就復(fù)蘇幾孔）

復(fù)蘇密度建議2：250個(gè)類器官/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

4、加膠-點(diǎn)板

向類器官沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

5、加液

將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200um-500um，可進(jìn)行傳代操作。

6、腦類器官鑒定圖

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