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K599 Electroporation-Competent Cell 發(fā)根(電擊)感受態(tài)細(xì)胞

基因型：

Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type)

簡(jiǎn)要說(shuō)明：

發(fā)根農(nóng)桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細(xì)菌，它能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及個(gè)別裸子植物。K599發(fā)根農(nóng)桿菌（NCPPB2659）含有pRi2659農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒，具有廣泛的宿主范圍（葫蘆科，豆科，茄科等），同時(shí)具有l(wèi)ian霉素抗性。 K599電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301質(zhì)粒（ka那霉素抗性）檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率>103 cfu/μg DNA

操作說(shuō)明：

一： 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

二： 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（體積不大于6ul，最好用試劑盒抽提，雙蒸水溶解；轉(zhuǎn)化效率較高，第一次使用前最好做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量），用手bo打管底混勻，立即插入冰中，用200μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?，蓋上杯蓋，空管保留待用。

三：?jiǎn)?dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作），將電擊杯從冰中拿出，吸水紙吸干外表面水份，快速放入電轉(zhuǎn)槽中，啟動(dòng)電擊，電擊完成快速插入冰中，加入1 ml無(wú)抗生素的TY，并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。

四： 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的TY平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天。

注意事項(xiàng)：

一：加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

二： 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中不可混入氣泡，轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

三：平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量或最終用于涂板的菌量。

四：K599具有l(wèi)ain霉素抗性，不可用于具有l(wèi)ian霉素抗性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。

備注：

1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、TY配方（1L）：

Tryptone 5gYeast extract 3g補(bǔ)水到1L體積，wan全溶解后，121度、20分鐘高溫滅菌配制1M的氯化鈣水溶液，121度、20分鐘高溫滅菌每1L 滅菌的TY液體營(yíng)養(yǎng)液中加入10ml 無(wú)菌的1M氯化鈣水溶液即可。若配制TY固體培養(yǎng)基，則加入15g 瓊脂粉。