腎素活性LIA用于通過化學(xué)發(fā)光免疫測定法定量測定人血漿中的腎素活性（PRA）。此套件僅供研究使用。不適用于診斷程序。

作為ALPCO在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強烈推薦ALPCO熱銷產(chǎn)品腎素活性LIA, 2 × 96孔。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

檢測原理：

該試劑盒測量血漿腎素活性，結(jié)果以每單位時間每單位體積人血漿產(chǎn)生的血管緊張素-I（Ang-I）的質(zhì)量（ng/mL.h）表示。血液樣本收集在含有EDTA的試管中。血漿被分離出來，或者冷凍保存，或者在室溫下保存以供立即使用。在pH值調(diào)節(jié)之前，在收集或處理過程中，不應(yīng)將樣品一次性冷卻或儲存在0至10°C的溫度下，因為這可能會導(dǎo)致對腎素活性的過高估計。在免疫測定開始之前，將蛋白酶抑制劑和生成緩沖液添加到血漿樣本中，這將防止血漿中的血管緊張素-I（Ang-I）降解。加入所提供的生成緩沖液后，血漿樣品的pH值應(yīng)在6.0左右。血漿樣本分為兩部分，分別在0-4°C（冰?。┖?7°C下孵育90分鐘或更長時間，以使血漿腎素在37°C時產(chǎn)生Ang-I?？蛇x地，pH值可以調(diào)節(jié)到6.5或7.4。pH值的調(diào)節(jié)是測定過程中的關(guān)鍵步驟，將血漿酸化至pH 3.3或更低并持續(xù)較長時間，隨后恢復(fù)到中性pH值會導(dǎo)致腎素的可逆激活（Derkx等人，1987），另一方面，在pH值高于8.0的條件下孵育會破壞腎素。在免疫測定培養(yǎng)過程中，涉及另一組蛋白酶抑制劑，其作用是阻止新一代Ang-I降解為小肽。Ang-I的免疫測定是一種競爭性檢測，使用兩次孵育，總檢測孵育時間不到兩小時。在第一次孵育期間，未標(biāo)記的Ang-I（存在于標(biāo)準(zhǔn)品、對照品和血漿樣本中）與生物s化的Ang-I競爭結(jié)合抗Ang-I抗體。在第二次孵育中，標(biāo)記的鏈霉抗生物s蛋白-HRP偶聯(lián)物與固定化的Ang-I-Biotin結(jié)合。洗滌和潷析程序可以去除未結(jié)合的物質(zhì)。加入發(fā)光HRP底物，在酰胺酶標(biāo)儀中測量產(chǎn)生的光（RLU）。RLU值與樣品中Ang-I的濃度成反比。使用一組校準(zhǔn)器繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從中可以直接讀取樣品中AngI的濃度。

測定程序：

1. 使所有試劑盒組分達到室溫。取出所需數(shù)量的微孔條并裝配到板架上。

2. 將每個校準(zhǔn)品、對照品和處理過的血漿樣本（37°C和0°C的等分）50 ?L分別加入相應(yīng)標(biāo)記的孔中，每個樣品做兩份。

3. 向每個孔中加入100 ?L的血管緊張素I-生物s結(jié)合物（推薦使用多通道移液管）。

4. 在平板振蕩器上（大約200轉(zhuǎn)/分鐘）在室溫下孵育60分鐘。

5. 用稀釋洗滌緩沖液清洗孔5次，每次每孔300 ?L。清洗后，將板子用力拍打在吸水紙上以去除殘留液體（推薦使用自動條帶清洗器）。正確執(zhí)行洗滌程序?qū)Ρ緶y定的性能有顯著影響。

6. 向每個孔中加入150 ?L的鏈霉親和素-HRP結(jié)合物工作溶液（推薦使用多通道移液管）。

7. 在平板振蕩器上（大約200轉(zhuǎn)/分鐘）在室溫下孵育30分鐘。

8. 用稀釋洗滌緩沖液清洗孔3次，每次每孔300 ?L（推薦使用自動條帶清洗器）。

9. 用蒸餾水或去離子水沖洗孔3次，每次每孔300 ?L。沖洗后，將板子用力拍打在吸水紙上以去除殘留液體（推薦使用自動條帶清洗器）。

10. 向每個孔中加入150 ?L的LIA底物工作溶液（推薦使用多通道移液管）。

11. 在加入底物后的10-30分鐘內(nèi)，在微孔板發(fā)光儀上測量每個孔的相對光單位（RLUs）。建議將測量時間設(shè)置為每孔1秒。

計算：

1. 使用免疫測定軟件，選擇4參數(shù)或5參數(shù)曲線擬合方法來計算結(jié)果。

2. 如果樣本讀數(shù)超過60ng/mL，則用校準(zhǔn)器A稀釋樣本，稀釋度不超過1:10，并重新運行樣本。所得結(jié)果應(yīng)乘以稀釋因子。

3. 使用下列公式計算每個樣本的血漿腎素活性（PRA）：PRA = [37°C的Ang-I] – [0°C的Ang-I] x 1.11 時間（小時）

其中時間（小時）是在生成步驟中使用的孵育時間。

典型校準(zhǔn)器曲線

僅示例曲線。請勿用于計算結(jié)果。

文獻參考：

1.Brossaud,J.,Corcuff JB.Clin.Chim.Act.410:90,2009

2.Bystrom CE et al.,Clin Chem,56:XXX,2010

3.Campbell,DJ,et al.,Clin.Chem.55:867,2009.

4.Cartledge,S.,Lawson,N.,Ann.Clin.Biochem.37:262,2000.

5.Derkx FH et al,J Biol Chem,262:2472,1987.

6.Hartman D,et al.,Clin Chem,50:2159,2004.

7.Pimenta E,Calhoum D,Hypertension,55:e17,2010.

8.Reudelhuber,TL,Hypertension,55:1071,2010.

9.Sealey,JE,J.Hypertension,13:27,1995.

10.Sealey,JE,Clin.Chem.37/10(B):1811,1991.

11.Sealey et al.,Trends Endocrin Metab,16:86,2005.

12.Ulmer PS,Weikle AW,Clin Chem.46:1442,2000.

ALPCO產(chǎn)品種類多樣，可測樣品來源包括人、大/小鼠、豚鼠、兔、豬、羊、狗、猴等，涉及神經(jīng)生物學(xué)、骨代謝、心血管疾病和氧化應(yīng)激、細胞因子與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖尿病和肥胖癥、內(nèi)分泌學(xué)、甲狀腺功能、腸胃病學(xué)、免疫學(xué)、生殖激素、抗體和抗原、分子診斷等多個研究領(lǐng)域，尤以糖尿病和肥胖癥研究領(lǐng)域見長。

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