NF-κB TWO-Luciferase Reporter HEK293 Cell Line 是一種設(shè)計(jì)用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞活性以及 NF-κB（核因子 Kappa B）活性的 HEK293 細(xì)胞系。它包含一個(gè)由 NF-κB 響應(yīng)元件驅(qū)動(dòng)的螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因，該元件位于最小 TATA 啟動(dòng)子上游的四個(gè)拷貝。此外，這種細(xì)胞系在 CMV 啟動(dòng)子的控制下恒定表達(dá) Renilla 熒光素酶，可用于確定細(xì)胞活性。這種細(xì)胞已經(jīng)通過(guò) TNFα（腫瘤壞死因子α）和抑制劑 IKK-16 二ys鹽進(jìn)行了驗(yàn)證。

背景

核因子 Kappa B (NF-κB)/Rel 蛋白包括 NF-κB2 p52/p100、NF-κB1 p50/p105、c-Rel、RelA/p65 和 RelB。這些蛋白作為二聚體轉(zhuǎn)錄因子，控制調(diào)節(jié)包括先天和適應(yīng)性免疫、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、B細(xì)胞發(fā)育和淋巴器官發(fā)生在內(nèi)的廣泛生物學(xué)過(guò)程的基因。它幾乎存在于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，并對(duì)細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)做出響應(yīng)，如應(yīng)激、自由基、紫外線輻射以及細(xì)菌和病毒。通過(guò)腫瘤壞死因子受體（TNFR）激活 NF-κB 是在與其相應(yīng)的配體 TNFα（腫瘤壞死因子α）結(jié)合時(shí)發(fā)生的。NF-κB 的激活增強(qiáng)了細(xì)胞炎癥并防止凋亡，這有助于腫瘤的發(fā)展。了解 NF-κB 通路及其調(diào)節(jié)方式對(duì)于理解健康和疾病中的基因調(diào)控至關(guān)重要。

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應(yīng)用

? 監(jiān)測(cè) NF-kB 活性。

? 篩選 NF-kB 信號(hào)通路的激活劑或抑制劑。

? 并行研究化合物對(duì) NF-kB 活性和細(xì)胞活性的影響。

細(xì)胞培養(yǎng)協(xié)議

注意：HEK293 細(xì)胞源自人類(lèi)材料，因此建議采取適當(dāng)?shù)陌踩A(yù)防措施。

細(xì)胞解凍

1. 在 37°C 水浴中搖晃裝有冷凍細(xì)胞的小瓶大約 60 秒。細(xì)胞解凍后（可能比 60 秒稍快或稍慢），迅速將小瓶的全部?jī)?nèi)容轉(zhuǎn)移到含有 10 ml 預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基 1 的試管中。

注意：在 37°C 的水浴中放置細(xì)胞過(guò)久會(huì)導(dǎo)致活性迅速喪失。

2. 立即以 300 x g 的速度離心細(xì)胞 5 分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在 5 ml 預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基 1 中重懸。

3. 將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 T25 或 T75 培養(yǎng)瓶中，并在 37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng) 24 小時(shí)后，檢查細(xì)胞附著和活性。更換培養(yǎng)基為新鮮的解凍培養(yǎng)基 1，并繼續(xù)在 37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 細(xì)胞應(yīng)在W全融合前傳代。在S次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基 1G。

細(xì)胞傳代

1. 抽去培養(yǎng)基，用無(wú) Ca2+/Mg2+ 的磷酸鹽緩沖液 (PBS) 沖洗細(xì)胞，并用 0.05% Y酶/EDTA 從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基 1G 并轉(zhuǎn)移到試管中。以 300 x g 的速度離心細(xì)胞 5 分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基 1G 中重懸。

3. 按照每周 1:5 到 1:10 的期望亞培養(yǎng)比例，將細(xì)胞種入新的培養(yǎng)容器中。

細(xì)胞冷凍

1. 抽去培養(yǎng)基，用無(wú) Ca2+/Mg2+ 的 PBS 沖洗細(xì)胞，并用 0.05% Y酶/EDTA 從培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞。

2. 一旦細(xì)胞分離，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基 1G 并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3. 以 300 x g 的速度離心細(xì)胞 5 分鐘，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞在 4°C 的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基 (BPS Bioscience #79796) 中重懸，細(xì)胞濃度約為 2 x 10^6 個(gè)細(xì)胞/ml。

4. 將 1 ml 的細(xì)胞懸浮液分裝到每個(gè)冷凍小瓶中。將小瓶放入保溫容器中緩慢冷卻，并在 -80°C 下保存過(guò)夜。

5. 次日將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期保存。

注意：建議在早期傳代時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞并至少冷凍 10 個(gè)小瓶以備將來(lái)使用。

圖 1. 在 hTNFα 存在下，NF-κB TWO-Luciferase Reporter HEK293 Cell Line 熒光素酶活性的細(xì)胞滴定曲線。

細(xì)胞在 96 孔板中以不同密度過(guò)夜培養(yǎng)，隨后在次日早晨用 hTNFα 處理。使用 TWO-Step Luciferase (Firefly & Renilla) 檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量了螢火蟲(chóng)和 Renilla 熒光素酶活性。結(jié)果以背景減去的發(fā)光信號(hào)顯示。

文獻(xiàn)參考：

Chen W., et.al., 2011 Front. Biosci. 16: 1172-1185

Schmeck B., et.al., 2007 Eur. Respir. J. 29: 25-33

BPS Bioscience是一家通過(guò)ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開(kāi)發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動(dòng)新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、CRISPR、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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NF-κB雙熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系NF-κB雙熒光素酶報(bào)告基因HEK293細(xì)胞系