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工作原理：
磷酸化胰島素受體 β（Ser177/181）檢測(cè)原理：
磷酸化胰島素受體 β（Ser177/181）檢測(cè)用于測(cè)量在 Ser177/181 位點(diǎn)磷酸化的胰島素受體 β。與蛋白質(zhì)印跡法不同，該檢測(cè)基于微孔板，不需要凝膠、電泳或轉(zhuǎn)膜。磷酸化胰島素受體 β（Ser177/181）檢測(cè)使用兩種標(biāo)記抗體，一種帶有供體熒光團(tuán)，另一種帶有受體。第一種抗體因其對(duì)蛋白質(zhì)上磷酸化基序的特異性結(jié)合而被選擇，第二種抗體因其能夠識(shí)別不依賴(lài)于其磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)的能力而被選擇。蛋白質(zhì)磷酸化使得涉及兩種標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物形成，這使供體熒光團(tuán)與受體緊密接近，從而產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）信號(hào)。其強(qiáng)度與樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度直接成正比，并在無(wú)需洗滌的檢測(cè)形式下提供了一種評(píng)估蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的方法。

磷酸化胰島素受體 β（Ser177/181）雙板檢測(cè)方案：
雙板方案涉及在 96 孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，然后進(jìn)行裂解，接著將裂解物轉(zhuǎn)移到 384 孔低體積檢測(cè)板中，之后加入磷酸化胰島素受體 β（Ser177/181）HTRF 檢測(cè)試劑。該方案能夠監(jiān)測(cè)細(xì)胞的活力和融合度。

磷酸化胰島素受體 β（Ser177/181）單板檢測(cè)方案：
使用 HTRF 試劑檢測(cè)磷酸化胰島素受體 β（Ser177/181）可以在一個(gè)用于培養(yǎng)、刺激和裂解的單板上進(jìn)行。無(wú)需洗滌步驟。這個(gè)為高通量篩選設(shè)計(jì)的方案能夠?qū)崿F(xiàn)微型化，同時(shí)保持強(qiáng)大的 HTRF 質(zhì)量。

檢測(cè)驗(yàn)證：
在 HepG2 細(xì)胞上的磷酸化胰島素受體 β（Tyr1150/1151）示例：
HepG2 細(xì)胞以每孔 100,000 個(gè)細(xì)胞的密度接種在 96 孔板上。在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育過(guò)夜后，在細(xì)胞下加入一系列稀釋的胰島素，在 37°C、5% 二氧化碳的條件下處理 5 分鐘。從細(xì)胞中移除刺激培養(yǎng)基，并向細(xì)胞中加入 50µL 的裂解緩沖液。通過(guò)輕輕振蕩 30 分鐘進(jìn)行裂解步驟。將 16µL 的樣品轉(zhuǎn)移到 384 孔小體積板中，然后加入 4µL 的磷酸化胰島素受體 β HTRF 檢測(cè)試劑。信號(hào)在過(guò)夜后記錄。

在 HepaRG 細(xì)胞上的磷酸化胰島素受體 β（Tyr1150/1151）示例：
HepaRG 細(xì)胞以每孔 200,000 個(gè)細(xì)胞的密度接種在 96 孔板上。在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育 5 天后，在細(xì)胞下加入一系列稀釋的胰島素，并在存在 30µM 過(guò)釩酸鹽的情況下，在 37°C、5% 二氧化碳的條件下處理 5 分鐘。從細(xì)胞中移除刺激培養(yǎng)基，并向細(xì)胞中加入 50µL 的裂解緩沖液。通過(guò)輕輕振蕩 30 分鐘進(jìn)行裂解步驟。將 16µL 的樣品轉(zhuǎn)移到 384 孔小體積板中，然后加入 4µL 的磷酸化胰島素受體 β HTRF 檢測(cè)試劑。同時(shí)，將 16µL 轉(zhuǎn)移到其他孔中，并加入 4µL 的總胰島素受體 β HTRF 檢測(cè)試劑。信號(hào)在過(guò)夜后記錄。

 磷酸化胰島素受體 β（Tyr1150/1151）與蛋白質(zhì)印跡法的比較：

人類(lèi) Hek 293 細(xì)胞培養(yǎng)至 80% 融合度。在胰島素和過(guò)釩酸鹽共同處理后，細(xì)胞被裂解，并通過(guò)離心收集可溶性上清液。對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行系列稀釋?zhuān)瑢⒚糠N稀釋液的 16µL 轉(zhuǎn)移到 384 孔低體積白色微孔板中，最后加入磷酸化胰島素受體 β 細(xì)胞檢測(cè)試劑盒試劑。并行比較顯示，HTRF 磷酸化檢測(cè)至少比蛋白質(zhì)印跡法靈敏 8 倍。