欧美……一区二区三区,欧美日韩亚洲另类视频,亚洲国产欧美日韩中字,日本一区二区三区dvd视频在线

孚約生物科技(上海)有限公司
中級會員 | 第7年

18016231680

光學(xué)儀器
徠卡Mateo TL倒置數(shù)字顯微鏡 孚約顯微鏡攝像頭相機(jī) 蔡司Axioscope 7光學(xué)顯微鏡 蔡司Stemi 508體視顯微鏡 奧林巴斯顯微鏡熒光裝置 相差顯微鏡 工業(yè)顯微鏡 材料顯微鏡 金相顯微鏡 偏光顯微鏡 奧林巴斯GX31P偏光顯微鏡 奧林巴斯GX41倒置顯微鏡 奧林巴斯GX71倒置顯微鏡 奧林巴斯GX51倒置顯微鏡 奧林巴斯BX41熒光顯微鏡 奧林巴斯BX51熒光顯微鏡 奧林巴斯CKX31倒置顯微鏡 奧林巴斯CKX41倒置顯微鏡 Leica徠卡S9 E體視顯微鏡 尼康SMZ1270體視顯微鏡 奧林巴斯GX53倒置顯微鏡 奧林巴斯CX22生物顯微鏡 奧林巴斯BX53M金相顯微鏡 奧林巴斯BX63生物顯微鏡 奧林巴斯IX83倒置顯微鏡 奧林巴斯顯微鏡鏡頭 Nikon尼康SMZ25體視顯微鏡 Nikon尼康LV100ND POL-DS偏光顯微鏡 Nikon尼康LV100N POL生物顯微鏡 Nikon尼康SMZ800N體式顯微鏡 Nikon尼康SMZ1270體視顯微鏡 奧林巴斯SZX16體視顯微鏡 奧林巴斯SZX10體視顯微鏡 奧林巴斯SZX7體視顯微鏡 尼康TS2-FL倒置顯微鏡 徠卡DMi1倒置顯微鏡 徠卡DM3000生物顯微鏡 徠卡DM2000生物顯微鏡 徠卡DM1000生物顯微鏡 徠卡DM750生物顯微鏡 徠卡DM500生物顯微鏡 尼康E200生物顯微鏡 尼康SMZ745T體視顯微鏡 尼康SMZ745體視顯微鏡 尼康Si生物顯微鏡 尼康Ei生物顯微鏡 奧林巴斯IX73倒置顯微鏡 奧林巴斯SZ61體視顯微鏡 奧林巴斯SZ51體視顯微鏡 奧林巴斯BX53生物顯微鏡 奧林巴斯BX43生物顯微鏡 奧林巴斯CX43生物顯微鏡 顯微鏡 尼康Ts2倒置顯微鏡 奧林巴斯CKX53倒置顯微鏡 奧林巴斯CX33生物顯微鏡 奧林巴斯CX23生物顯微鏡 生物顯微鏡 體視顯微鏡 熒光顯微鏡 倒置顯微鏡
生命科學(xué)
BioRad伯樂PTC Tempo梯度pcr 細(xì)胞破碎儀 賽默飛240i二氧化碳CO2培養(yǎng)箱 賽默飛311二氧化碳CO2培養(yǎng)箱 賽默飛371二氧化碳CO2培養(yǎng)箱 賽默飛i160二氧化碳CO2培養(yǎng)箱 賽默飛NanoDropOneC紫外光度計 賽默飛NanoDropOne紫外光度計 艾本德Mastercycler® X50s PCR 賽默飛Qubit Flex分光光度計 賽默飛細(xì)胞計數(shù)光立方 賽默飛VeritiPro PCR儀 賽默飛QuantStudio7 賽默飛QuantStudio5 PCR 賽默飛QuantStudio3 PCR 伯樂CFX Connect PCR儀 伯樂S1000 PCR儀 伯樂C1000 Touch PCR 儀 伯樂CFX Opus 96 PCR 伯樂CFX Duet熒光定量PCR 伯樂CFX Opus Deepwell 伯樂TC20細(xì)胞計數(shù)器 賽默飛QuantStudio1 PCR 賽默飛StepOnePlus實時熒光定量PCR 賽默飛7500實時熒光定量PCR 賽默飛ProFlex 3x32梯度PCR 賽默飛SimpliAmp PCR儀 賽默飛MiniAmpPlus PCR儀 賽默飛MiniAmp普通PCR儀 賽默飛Qubit4.0分光光度計 賽默飛Countess™ 3細(xì)胞計數(shù)儀 賽默飛Countess™ 3FL細(xì)胞計數(shù)儀 伯樂T100 光度計 蛋白印跡儀 凝膠成像系統(tǒng) PCR儀 酶標(biāo)儀 洗板機(jī) 電穿孔儀 樣本破碎 DNA測序儀 細(xì)胞計數(shù)儀 電泳儀電泳槽 伯樂T100梯度PCR儀 核酸定量儀熒光計 實時熒光定量PCR儀
實驗通用
賽默飛1500系列生物安全柜 賽默飛1300系列安全生物柜 賽默飛4111FO水套式CO2培養(yǎng)箱 賽默飛311 CO2培養(yǎng)箱 賽默飛371直熱式CO2培養(yǎng)箱 賽默飛3111水套式CO2培養(yǎng)箱 賽默飛i160直熱式CO2培養(yǎng)箱 艾本德5804R冷凍離心機(jī) 賽默飛ST4R冷凍離心機(jī) 賽默飛ST4離心機(jī) 賽默飛Micro21R冷凍離心機(jī) 賽默飛Micro21微量離心機(jī) 賽默飛Micro17微量離心機(jī) 精騏擺床 精騏混勻儀 精騏干式恒溫器 精騏振蕩器/搖床 CryStal精騏振蕩器/搖床 賽默飛ST40離心機(jī) 賽默飛ST1 Plus離心機(jī) 大龍離心機(jī) 大龍移液器 大龍金屬浴 大龍搖床 大龍混勻儀振蕩器 凱杰樣本研磨儀TissueLyser III 艾本德5430R冷凍離心機(jī) 艾本德5425R冷凍離心機(jī) 艾本德5425微量離心機(jī) 艾本德5420微量離心機(jī) 艾本德MiniSpin離心機(jī) 離心機(jī)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)頭 賽默飛ST1R冷凍離心機(jī) 加熱模塊 混勻儀熱蓋 賽默飛mySPIN-6Mini離心機(jī) 賽默飛ST8R冷凍離心機(jī) 賽默飛Pico21微量離心機(jī) 賽默飛Pico17微量離心機(jī) 艾本德5810R冷凍離心機(jī) 艾本德ThermoMixer C混勻儀 賽默飛Micro17R冷凍離心機(jī) 賽默飛Fresco17冷凍離心機(jī) 賽默飛Fresco21冷凍離心機(jī) 電子天平 水分測定儀 電導(dǎo)率儀 磁力攪拌器 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱 電阻儀 二氧化碳培養(yǎng)箱 濃縮儀 分光光度計 分度計 低溫冰箱 程序降溫儀 酸度計PH計 儲存液氮罐 搖床 小型臺式離心機(jī) 滅菌鍋 水分儀 天平萬分之一 藥品冷藏箱 恒溫振蕩器 混勻攪拌器 超凈工作臺 電化學(xué)儀器 生化培養(yǎng)箱 干燥箱烘箱 恒溫水浴鍋 光譜色譜儀
耗材血清

PCR實驗步驟

時間:2019/3/26閱讀:3755
分享:

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)是體外酶促合成特異DNA,片段的一種方法,為常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。典型的PCR由(1)高溫變性模板;(2)引物與模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán),通過多次循環(huán)反應(yīng),使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是:將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下(通常為93℃-94℃)使其變性解成單鏈;人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合,兩個引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長短;耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入,以目的基因為模板從5’→3’方向延伸,合成DNA的新互補(bǔ)鏈。

PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DNA,片段,并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克、微克、毫克級的特異性DNA,片段。因此,PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析,還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建,基因表達(dá)調(diào)控的研究,基因多態(tài)性的分析,遺傳病和傳染病的診斷,腫瘤機(jī)制的探索,法醫(yī)鑒定等諸多方面。通常,PCR在分子克隆和DNA分析中有著以下多種用途:

(1) 生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針;

(2)  由少量mRNA生成 cDNA文庫;

(3) 從cDNA中克隆某些基因;

(4) 生成大量DNA以進(jìn)行序列測定;

(5) 突變的分析;

(6) 染色體步移;

(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態(tài)性分析等。

 

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模版

2.對應(yīng)目的基因的特異引物

3.10×PCR Buffer 

4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5.Taq酶

 

二、操作步驟 

1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

       10×PCR buffer                     5 μl

       dNTP mix (2mM)               4 μl

     引物1(10pM)                   2 μl

     引物2(10pM)                   2 μl

       Taq酶 (2U/μl)                 1 μl

       DNA模板(50ng-1μg/μl)    1 μl

       加ddH2O至                       50 μl

    視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。

2. 調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,后在72℃ 保溫7min。

3. 結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μl三氯甲烷進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。

 

三、PCR反應(yīng)體系的組成與反應(yīng)條件的優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液(10×PCR Buffer)、脫氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1,Primer2)、靶序列(DNA模板)五部分組成。各個組份都能影響PCR結(jié)果的好壞。

1. 反應(yīng)緩沖液:一般隨Taq DNA聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含:50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH8.3室溫),1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高,使反應(yīng)特異性降低;濃度過低,使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為200μM時,Mg2+為1.5mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物,可適當(dāng)增加Mg2+的濃度。在高濃度DNA及dNTP條件下進(jìn)行反應(yīng)時,也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗,一般以1.5-2mM(終濃度)較好。

2. dNTP :高濃度dNTP易產(chǎn)生錯誤摻入,過高則可能不擴(kuò)增;但濃度過低,將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR中常用終濃度為50-400μM的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應(yīng)相同,如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入作用,降低合成速度,過早終止延伸反應(yīng)。此外,dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。因此,dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的Mg2+濃度。

3. Taq DNA聚合酶酶:在100μl反應(yīng)體系中,一般加入2-4U的酶量,足以達(dá)到每min延伸1000-4000個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是,不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異,由于酶的濃度對PCR反應(yīng)影響極大,因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時(如20μl或50μl),一般酶的用量仍不小于2U,否則反應(yīng)效率將降低。

4. 引物:引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵,引物設(shè)計在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增,通常引物設(shè)計要遵循以下幾條原則:

⑴ 引物的長度以15-30bp為宜,一般(G+C)的含量在45-55%,Tm值高于55℃[Tm=4(G+C)+2(A+T)]。應(yīng)盡量避免數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列,堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機(jī)的。

⑵ 引物的3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ),避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu),兩個引物在3’端不應(yīng)出現(xiàn)同源性,以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對堿基數(shù)少于5個,引物自身配對若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),莖的堿基對數(shù)不能超過3個由于影響引物設(shè)計的因素比較多,現(xiàn)常常利用計算機(jī)輔助設(shè)計。

⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換HPLC進(jìn)行純化。

⑷ 引物濃度不宜偏高,濃度過高有兩個弊端:一是容易形成引物二聚體(primer-dimer),二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時,容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來,用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì),而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/μl較好。

⑸  引物一般用TE配制成較高濃度的母液(約100μM),保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。

5. 模板:PCR對模板的要求不高,單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用極微量的樣品(甚至是來自單一細(xì)胞的DNA)作為摸板,但為了保證反應(yīng)的特異性,一般還宜用μg水平的基因組DNA或104拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品,某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增,但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白,將可能干擾PCR反應(yīng)。

6. PCR循環(huán)加快,即相對減少變性、復(fù)性、延伸的時間,可增加產(chǎn)物的特異性。

 

四、注意事項

1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。設(shè)立一個的PCR實驗室。

2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。

3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

4.PCR試劑配制應(yīng)使用高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

6.試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開,并且要充分混勻

會員登錄

×

請輸入賬號

請輸入密碼

=

請輸驗證碼

收藏該商鋪

X
該信息已收藏!
標(biāo)簽:
保存成功

(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)

常用:

提示

X
您的留言已提交成功!我們將在第一時間回復(fù)您~
撥打電話
在線留言
97人妻精品一区二区三区视频| 国产日韩一区二区三区在线播放| 国产精品亚洲一区二区三区下载| 大阴茎交于大阴户黄片视频| 久操视频中文字幕在线观看| 国产精品视频一区二区三区八戒| 大肌巴日小个子女人视频| 美女大骚逼幸福遍穴| 久久久精品欧美一区二区三免费| 强奸啪啪啪好大欧美| 久久久久久亚洲精品首页| 日韩视频无码日韩视频又2020| 亚洲AV无码一区二区三区天堂古| 极品一区二区三区av| 国语自产免费精品视频在| 欧美性做爰片免费视频看| 国产 欧美 日韩 黄片| 区国产精品搜索视频| 精品国产99亚洲一区二区三区| 日本免费精品一区二区三区四区| 大肉棒插了按摩视频| 中文字幕在线观看第二页| 中国美女操逼的视频| 日韩一区二区三区国色天香| 精品一区二区av天堂色偷偷| 中文字幕一区二区三区中文字幕| 免费的黄片很很操| 中文字幕一区二区三区中文字幕| 爱男爽高潮鸡穴视频| 日韩素人精品亚洲热一区| 黄色三极片在线观看| 天堂久久久久久久久久久| 欧美人与兽大屌肛交爆菊| 麻豆国产欧美一区二区三区r| 少妇毛片一区二区三区免费视频| 鸡巴插骚逼视频欧美风格| 俩男人插下面的视频| 神马我不卡手机在线观看| 99精品欧美一区二区三区喷胶| 亚洲人成在线不卡网| 青青河边草直播免费观看|