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谷氨酸脫羧酶（GAD）測定試劑盒說明書
閱讀：343 發(fā)布時間：2023-10-7本試劑盒僅供科研使用
谷氨酸脫羧酶（GAD）測定試劑盒說明書
（貨號：WS2011F 分光法 24 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 谷氨酸脫羧酶 (GAD，EC 4.1.1.15)是一種吡哆醛類裂解酶，能專一的催化 L-谷氨酸 裂解成為 γ-氨基丁酸 (GABA)和 CO2。GAD 廣泛分布于動植物和微生物中：哺乳動物 體內(nèi) GAD 催化產(chǎn)生的 GABA 是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)；在植物中 GAD 的活性高 低可指示種子發(fā)芽能力和出苗率等。 本試劑盒利用苯酚和次氯酸鈉比色法測定谷氨酸脫羧酶（GAD）催化產(chǎn)生的 GABA， 最終生成藍(lán)色物質(zhì)，該物質(zhì)在 645nm 處有明顯光吸收，其顏色深淺與 GABA 含量呈正 比，進(jìn)而得出 GAD 活力大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 6mL 試劑二溶解備用。 試劑二 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 1.5mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 A：液體 4.4mL×2 瓶 B：液體 5mL×1 瓶 4℃保存 臨用前取 2.2mL 的 B 液進(jìn)一瓶 A 液 中，混勻后作為試劑六使用?；靹?后的試劑半個月內(nèi)用完。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該標(biāo)曲。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器。 四、谷氨酸脫羧酶（GAD）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、 樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min， 取上清液待用。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì) 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s， 重復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、 上機(jī)檢測： ① 可見分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 645nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 100 100 試劑一 200 試劑二 200 混勻，40℃孵育 30min。本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 200 200 混勻，室溫 12000rpm，離心 3min，上清液待測。 ③ 顯色反應(yīng)：在 EP 管中依次加入： 上清液 200 200 試劑三 125 125 試劑四 25 25 試劑五 200 200 試劑六 200 200 混勻，20℃放置 20min，取全部澄清上清液至 1mL 玻 璃比色皿（光徑 1cm）中，于 645nm 處讀取各管的 A 值，△A=A 對照-A 測定(每個樣本需做一個自身對照)。 【注】若ΔA 值在零附近，可增加樣本質(zhì)量 W（如增至 0.2g），或延長 40℃孵育時間 T（如增 至 1h 或更長），或加大樣本量 V1（如增至 300μL，則試劑三相應(yīng)減少），則改變后的 W 和 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 2.0976x - 0.0059，x 為標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量(μmol)，y 為吸光值ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GAD(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T×103 =397.3×(ΔA+0.0059)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GAD(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T×103 =397.3×(ΔA+0.0059)÷W 4、按細(xì)胞數(shù)量計算： 單位定義：每 104個細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GAD(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T×103 =0.8×(△A+0.0059) 5、按照液體體積計算： 單位定義：每毫升液體每分鐘產(chǎn)生 1nmol 的 GABA 定義為一個酶活力單位。 GAD(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0059)÷2.0976]×(V2÷V3)÷V1÷T=397.3×(ΔA+0.0059) V---提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL； V2---反應(yīng)體系總體積：0.5mL； V3---第②步顯色階段上清液量，0.2mL； T---反應(yīng)時間，30min； W---樣本質(zhì)量，g； 標(biāo)準(zhǔn)品 GABA 分子量---103.12； 500---細(xì)胞數(shù)量，萬； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：向 EP 管中加入 2mL 蒸餾水；把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3 mg/mL。也可根據(jù)實際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 2 按照顯色反應(yīng)階段的測定管加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。