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注意事項
1、必須活細胞檢測，不能用能破壞細胞膜完整性的固定劑和穿透劑固定或穿膜。
2、特殊細胞的染色方法：在消化或吹打時，有些細胞（如神經(jīng)元細胞）很容易受到損傷，導致晚期凋亡或壞死比例非常高，不能反映真實結果。實驗的解決方法：先低速離心，吸取細胞培養(yǎng)板中的液體，留少許液體，加入適量PI和Annexin-V染色10min后，將漂浮細胞吸至離心管中，離心洗滌兩次，用PBS漂洗貼壁細胞兩次，加胰酶消化后將細胞懸液移至另一離心管中，離心洗滌，再與漂浮細胞合并后上流式細胞儀檢測。應用該法可降低晚期凋亡和壞死比例，增加早期凋亡細胞比例。
3、由于Annexin-V為鈣離子依賴的磷脂結合蛋白，只有在鈣離子存在的情況下與PS的親和力才大，因而在消化細胞時，建議一般不采用含EDTA的消化液。
4、必須設置陰性對照和補償對照（分別單染）。
流式細胞凋亡檢測服務與流式細胞凋亡檢測服務實驗步驟相近：
1. 凋亡細胞的制備
小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg體重，10 h后解剖取胸腺，分離胸腺細胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測細胞的濃度為2×106 /ml，備用。
2. 200 μl細胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘，棄上清。
3. 重復步驟2兩次。
4. 將細胞重懸于200 μl 標記緩沖液。
流式細胞凋亡檢測服務和流式細胞凋亡檢測服務注意事項：
1. 整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4 ℃下操作。
2. 反應完畢后要盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態(tài)的過程，反應一小時后熒光強度就開始衰變。
3. Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時要注意避光。
流式細胞凋亡檢測服務如何避免出現(xiàn)假陽性結果？細胞接種不易過密：接種對數(shù)生長期的細胞時密度不要＞1*106，以免細胞培養(yǎng)過程中自身引起凋亡，而非外界處理因素；
避免消化過度：因消化過度可能會造成PS外翻，得到假陽性的結果。因此消化時最好用低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細胞2-3次，盡量把胰酶造成損傷可以控制在5%以內(nèi)，加上對照組的情況下對實驗結果不會造成明顯影響；
操作盡量輕柔：收集細胞時力度過大很可能造成細胞膜損傷，導致細胞膜的磷脂層暴露，從而結合Annexin V，導致假陽性，因此處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷。
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素biotinylate標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結合，后者又與POD底物H2O2、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）產(chǎn)生深棕色反應，特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。
tunel流式細胞凋亡檢測服務(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于經(jīng)過固定和洗滌的細胞或組織，只要經(jīng)過一步染色反應，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或tunel流式細胞凋亡檢測服務檢測到呈現(xiàn)綠色熒光的凋亡細胞。
tunel流式細胞凋亡檢測服務(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于經(jīng)過固定和洗滌的細胞或組織，只要經(jīng)過一步染色反應，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或tunel流式細胞凋亡檢測服務檢測到呈現(xiàn)綠色熒光的凋亡細胞。
細胞凋亡(apoptosis)是一件主動性細胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控，是細胞為更好地適應環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。具體表現(xiàn)為：出芽形成凋亡小體、核小體間DNA的切割，凋亡小體被吞噬和消化等幾個連續(xù)過程等.
細胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時
抽提DNA進行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上綠色熒光探針熒光素(FITC)標記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或tunel流式細胞凋亡檢測服務進行檢測，這就是TUNEL法檢測細胞凋亡的原理。注：FITC是fluorescein isothiocyanate的縮寫，實際上大多數(shù)情況下所謂的FITC即為fluorescein。
有如下優(yōu)點：
(1)高靈敏度：背景染色極低，陽性染色明亮，可以在單細胞水平檢測到細胞凋亡，同時由于凋亡早期就有DNA斷裂，可以檢測到早期的細胞凋亡。
(2)特異性：TUNEL檢測時通常更容易標記凋亡細胞，而不容易標記壞死細胞。
(3)快速：僅需約1-2個小時即可完成。
(4)方便：只需一步染色反應，洗滌后即可觀察，不必使用二抗等進行多步操作。
(5)應用范圍廣：可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。
TUNEL法特異性檢測細胞凋亡時產(chǎn)生的DNA斷裂，但不會檢測出射線等誘導的DNA斷裂(和細胞凋亡時的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區(qū)分開，另一方面也不會把射線等誘導發(fā)生DNA斷裂的非凋亡細胞判斷為凋亡細胞。
極少數(shù)細胞凋亡時沒有DNA斷裂，此時不適用TUNEL法檢測。在個別類型的壞死細胞中也發(fā)現(xiàn)TUNEL檢測呈陽性。在需要嚴格判斷細胞凋亡的情況下，同時檢測多個凋亡指標。
細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細胞的生命現(xiàn)象之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復及自身反應性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細胞凋亡過度有關，自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關。細胞凋亡有別于細胞壞死，它有一系列的細胞形態(tài)學和生物化學的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細胞膜的內(nèi)側，但在凋亡的細胞，PS 從細胞膜的內(nèi)側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。因此將Annexin-Ⅴ進行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標記，以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞凋亡檢測服務或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。
