實(shí)驗(yàn)方法原理

利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過(guò)GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結(jié)合。因此，當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過(guò)層析柱時(shí)或與此固相復(fù)合物混合時(shí)就可被吸附而分離。

GST-pulldown主要包括以下三個(gè)部分：①利用基因重組技術(shù)構(gòu)建帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體；②通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白；③利用GST親和純化柱進(jìn)行蛋白純化獲得高純度的融合蛋白，再利用GST親和純化柱進(jìn)行蛋白間的相互作用檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)操作程序：

材料及試劑

探針蛋白與GST融合的原核蛋白，裂解的細(xì)胞蛋白，或者組織蛋白提取物

細(xì)胞蛋白裂解液，洗脫液：PBS及PBS+1%Triton-100

（以下流程僅供研究已知原核蛋白A和真核過(guò)表達(dá)蛋白B相互作用）

1：原核融合蛋白A的獲得

1.1：將編碼蛋白A與GST的重組質(zhì)粒化轉(zhuǎn)BL21(DE3)菌株

1.2：挑取單個(gè)克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml試管里，37℃培養(yǎng)過(guò)夜

1.3：將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L錐形瓶中，37℃，225rpm培養(yǎng)至OD600≈1.0-1.5左右，加入適當(dāng)濃度的IPTG，在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間（誘導(dǎo)條件需要根據(jù)不同的蛋白做調(diào)整），6000g，10分鐘，4℃離心收集細(xì)菌，去盡上清，將菌體至于-20℃放置O/N

1.4：室溫凍融菌體，馬上置于冰上，每500ml培養(yǎng)液加入10-20ml細(xì)菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混勻

1.5：冰上超聲破碎，開(kāi)2秒，停9秒，總40-60分鐘。至裂解液充分清涼

1.6：11000rpm，15分鐘，4℃離心分離上清， -80℃保存?zhèn)溆?/span>

2：真核融合蛋白B的獲得

2.1：將編碼B蛋白的堿基序列克隆到編碼標(biāo)簽蛋白（如HA,或者myc）的真核表達(dá)載體上，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染

3：48小時(shí)后，取適量融合蛋白GST-A 于冰上凍融

4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100潤(rùn)洗一次，將凍融融合蛋白GST-A與之混勻，4℃層析柜旋轉(zhuǎn)結(jié)合1小時(shí)。

5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（ PBS+Beads）作Offer。

6：同時(shí)，裂解真核融合蛋白B，去盡培養(yǎng)基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well為例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分鐘。

7：吹打收集至1.5mlEP管，超聲破碎。13000rpm，15分鐘，4℃離心取上清。

8：BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其余樣品加入到已純化蛋白的EP管中，用PBS補(bǔ)足液體到600ul左右，以便蛋白之間能充分結(jié)合！4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。

10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分鐘，高速離心，Run –SDS PAGE做Western Blot檢測(cè)。用HA或者myc Blot

注意事項(xiàng)：

內(nèi)源性蛋白的干擾使得實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果較多：

（1）高純度的GST融合蛋白能夠減少實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性。由于高純度的融合蛋白能減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性，因此獲得高純度的融合蛋白對(duì)于GST-pull down 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分析具有重要的作用。同時(shí)，為了能夠盡可能的保證融合蛋白原有的生物學(xué)活性，一般在獲取融合蛋白時(shí)傾向于可溶性融合蛋白，因此獲得高純度的可溶性蛋白很關(guān)鍵。

（2）對(duì)于可溶性蛋白的獲得條件主要有①載體的選擇。②可溶性蛋白表達(dá)條件的選擇，③誘導(dǎo)溫度，④誘導(dǎo)時(shí)間，⑤誘導(dǎo)物的濃度，能夠不被細(xì)胞代謝而且具有穩(wěn)定的濃度。