概述

經(jīng)典條件性恐懼，是評估恐懼學(xué)習(xí)和記憶的可靠模型。在條件性恐懼期間，動(dòng)物學(xué)會(huì)將先前的非威脅性刺激（指-定為條件刺激或CS）與先天有害刺激（指-定為非條件刺激或US）聯(lián)系起來。如果這種CS-US關(guān)聯(lián)被成功學(xué)習(xí)和記住，先前中性的CS本身將成為US的預(yù)測因子，從而引發(fā)原來US觸發(fā)的恐懼反應(yīng)（指-定為條件反應(yīng)或CR）。另外，在此過程中，動(dòng)物還會(huì)學(xué)習(xí)到情境與US的關(guān)聯(lián)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

條件性恐懼實(shí)驗(yàn)設(shè)備的主要和基本組成部分是：條件性恐懼測試室、隔音通風(fēng)箱和控制軟件。測試室具有導(dǎo)電格柵的地板、電擊發(fā)生器以及紅外探測器，測試室通常由透明有機(jī)玻璃制成，可將小鼠的嵌套在大鼠的測試室中。其實(shí)大鼠尺寸的測試室也可以用于小鼠。為了防止動(dòng)物在受到厭惡刺激時(shí)會(huì)跳出測試室，強(qiáng)烈建議測試室設(shè)置為有頂蓋的。測試室放置在隔音箱中，隔音箱配備有一個(gè)照明燈、一個(gè)小風(fēng)扇、聲音發(fā)生器以及一個(gè)與聲音發(fā)生器相聯(lián)的擴(kuò)音器、攝像機(jī)和錄音設(shè)備。風(fēng)扇用于通風(fēng)和產(chǎn)生背景噪音，這對于以聲音作為CS的情況尤其重要。不同刺激的呈現(xiàn)由具有相應(yīng)軟件的計(jì)算機(jī)控制。

VisuFcs條件性恐懼實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，型號(hào)：XR-XC404,上海欣軟

動(dòng)物的行為通常由安裝在頂部的攝像機(jī)或位于測試室周圍框架中的紅外傳感器記錄。視頻記錄或來自紅外傳感器的信號(hào)可以使用指-定的軟件自動(dòng)分析。另一種選擇是在事件記錄器軟件的幫助下人工分析視頻記錄。其他組件包括用于改變測試環(huán)境外觀的備用地板和墻板等。特定的測試室尺寸可能會(huì)有所不同，但是它們必須適合動(dòng)物（例如，格柵地板間距對大鼠來說更寬），并允許自由移動(dòng)和探索。對于聽覺條件恐懼范式，可以安裝一個(gè)動(dòng)物不可見的LED指示燈在測試小室內(nèi)，可以用于在沒有音軌的視頻記錄上指示聲音刺激的呈現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1、由于跨物種恐懼環(huán)路的保守性，所有品系的實(shí)驗(yàn)室大鼠和小鼠都可用于經(jīng)典的條件性恐懼范式。一般來說，條件性恐懼行為測試的一個(gè)重要考慮因素是嚙齒動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)時(shí)的年齡。條件性恐懼反射可以在任何年齡的動(dòng)物身上建立，然而，在非常年幼和青少年的動(dòng)物中，學(xué)習(xí)和記憶表型與成年動(dòng)物有很大的不同。對于學(xué)習(xí)和記憶能力缺陷或增強(qiáng)的一般表型，一般使用成年動(dòng)物（通常周齡在8至16周之間）。

2、從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商處訂購進(jìn)入設(shè)施的動(dòng)物應(yīng)被允許適應(yīng)新的飼養(yǎng)條件一周或更長時(shí)間。

3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)飼養(yǎng)在光照、溫度和潛在應(yīng)激源（如籠子變化、同籠數(shù)量或其他干擾）的統(tǒng)一條件下。

4、除非情況要求單籠飼養(yǎng)（如手術(shù)后的動(dòng)物或具有高度攻擊性的動(dòng)物），否則不應(yīng)單獨(dú)飼養(yǎng)嚙齒動(dòng)物，因?yàn)檫@可能會(huì)對行為結(jié)果產(chǎn)生不利影響。大鼠通常每個(gè)籠子飼養(yǎng)兩到三只，而每個(gè)籠子最多可以飼養(yǎng)五只小鼠。對于具有攻擊性的小鼠品系，例如C57BL/6小鼠，每籠飼養(yǎng)的雄性小鼠少于5只可能是最佳的。

5、每個(gè)實(shí)驗(yàn)組所需的動(dòng)物數(shù)量應(yīng)通過功效分析確定。通常一般情況下7-10只大鼠或10-15只小鼠可以提供足夠的統(tǒng)計(jì)功效。

關(guān)鍵參數(shù)

1. CS

在經(jīng)典條件性恐懼實(shí)驗(yàn)中，CS幾乎可以是任何離散的非威脅性線索，例如聲音，光線或氣味。在聽覺條件性恐懼中，常用的CS是一種使用單一頻率音調(diào)的中性非有害聲音, 例如，2-10 kHz范圍內(nèi)的聽覺刺激，其強(qiáng)度約為80 dB。CS呈現(xiàn)的持續(xù)時(shí)間因研究而異，范圍從2 s到30 s不等。

2. US

US是有害的或輕度疼痛的。最-常-用的US是輕度電擊，電刺激的優(yōu)點(diǎn)是它們的參數(shù)定明確，并且易于控制和管理。如果對動(dòng)物的腳施加電刺激，它們也被稱為“足部電擊”。電刺激的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間不同，強(qiáng)度可能在 0.4 至 1 mA之間變化，持續(xù)時(shí)間通常為 0.5 s至 2 s 之間。

3. 跟蹤配對刺激

當(dāng) CS 和 US 在整個(gè)測試中重復(fù)出現(xiàn)但兩者不是同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，稱為跟蹤配對刺激（圖1）。US通常在CS呈現(xiàn)結(jié)束后的相對較短的固定時(shí)間間隔內(nèi)出現(xiàn)，一般約10 - 20 s，但足以在CS和US之間形成聯(lián)系。但是幾個(gè)CS-US配對之間時(shí)間間隔要長一些，大約2.5 - 4.5 min。

4. 延遲配對刺激

當(dāng)US與CS的呈現(xiàn)共同終止（即，電擊在CS結(jié)束時(shí)精確地傳遞），這被稱為延遲配對刺激（圖1）。在正常情況下，條件反應(yīng)在延遲配對刺激處理中比在跟蹤配對刺激中更強(qiáng)，因?yàn)镃S-US配對在時(shí)間上更緊密地聯(lián)系在一起。跟蹤配對刺激激活海馬，而延遲配對刺激主要激活杏仁核。因此，選擇哪種范式將取決于所要解決的科學(xué)問題。

圖 1：跟蹤配對刺激與延遲配對刺激條件性恐懼的示意圖

實(shí)驗(yàn)程序（測試方法）

1、線索條件性恐懼測試（cued fear conditioning）

2、情境條件性恐懼測試

3、恐懼增強(qiáng)性驚嚇

4、條件性恐懼記憶的消退

凍結(jié)時(shí)間通常表示為 CS 持續(xù)時(shí)間的百分比，并在每次測試中取平均值。例如，如果一只動(dòng)物在30秒的長CS呈現(xiàn)過程中凍結(jié)了24秒，就代表它在該試驗(yàn)中顯示出80%的凍結(jié)反應(yīng)。評價(jià)情境恐懼時(shí)，可以使用凍結(jié)時(shí)間占整個(gè)測試持續(xù)時(shí)間的百分比作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。對于消退測試，應(yīng)對測試中的每個(gè)CS進(jìn)行單獨(dú)分析，而不是取平均值，因?yàn)閮鼋Y(jié)行為會(huì)逐漸減少。如果CS呈現(xiàn)的數(shù)量非常多，單獨(dú)分析每個(gè)CS下的凍結(jié)行為導(dǎo)致曲線非常雜亂，則可以將連續(xù)幾個(gè)（2-5個(gè)）CS作為一個(gè)試驗(yàn)塊，將每個(gè)試驗(yàn)塊的數(shù)據(jù)平均，這可能有助于簡化曲線。在情境恐懼消退的情況下，可以將測試分解為例如 1 或 2 分鐘的間隔，以評估恐懼消退的獲得。另一個(gè)不太常用的參數(shù)是凍結(jié)行為次數(shù)，以總數(shù)表示。

驚嚇反應(yīng)顯示出一定程度的個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間變異性，因此需要進(jìn)行較多試驗(yàn)，并且推薦匹配方式分組，即根據(jù)基線驚嚇反應(yīng)將小鼠或大鼠分配到實(shí)驗(yàn)組和對照組，以確保在實(shí)際實(shí)驗(yàn)開始之前各組均值彼此之間沒有差異。除了恐懼CS 驚嚇刺激試驗(yàn)外，還包含單獨(dú)的驚嚇刺激試驗(yàn)。對“單獨(dú)驚嚇”和“CS驚嚇”的平均反應(yīng)的差異稱為恐懼增強(qiáng)，以絕對值或“單獨(dú)驚嚇”幅度的百分比變化來表示。

通常建議不要只分析條件性恐懼的單一測量，特別是如果使用的設(shè)置和/或方案允許測試更多的恐懼反應(yīng)。例如，動(dòng)物可以將恐懼反應(yīng)從凍結(jié)行為轉(zhuǎn)換為逃跑反應(yīng)。這種逃跑反應(yīng)也可以通過跟蹤軟件中的速度閾值自動(dòng)檢測。如果不知道逃跑反應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中增加，那么在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中觀察到凍結(jié)減少將被錯(cuò)誤地解釋為恐懼減少。