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RNA 在調(diào)控和基因表達(dá)中起重要作用,并在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。因此,獲得充足且高質(zhì)量的植物RNA產(chǎn)量對許多生物科學(xué)領(lǐng)域至關(guān)重要。
植物 RNA 的幾個特征使其提取具有挑戰(zhàn)性。在本文中,我們將討論這些特征、RNA 的類型、植物 RNA 提取的主要步驟、如何量化產(chǎn)量和驗證植物 RNA 的質(zhì)量,以及更好地提取植物 RNA 的一些技巧。
什么是RNA?
RNA是分子核糖核酸的縮寫。RNA是每個生物體非常重要的分子。它由四種類型的核糖核苷酸堿基組成,稱為腺嘌呤 (A)、胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G) 和尿嘧啶 (U)。有時,將 RNA 比作參考書上的副本(在這種情況下來自 DNA)。
RNA 是單鏈分子,含有核糖(而不是 DNA 中存在的脫氧核糖)。核糖含有用 OH 表示的羥基。這些羥基使 RNA 更具反應(yīng)性并易于水解,從而導(dǎo)致分子不穩(wěn)定并使其更容易降解。由于其不穩(wěn)定性,操作 RNA 時必須更加小心。
RNA的類型
在植物中,您可以識別三種主要類型的 RNA:
信使 RNA (mRNA):一種轉(zhuǎn)錄 DNA 序列并編碼蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)產(chǎn)物的分子。
核糖體 RNA (rRNA):這種 RNA 是核糖體結(jié)構(gòu)的一部分,對所有生物體的蛋白質(zhì)合成至關(guān)重要。rRNA 構(gòu)成了核糖體中的主要物質(zhì),按重量計大約為 60% 的 rRNA 和 40% 的蛋白質(zhì)。
轉(zhuǎn)移 RNA (tRNA):這種類型的 RNA 分子將 mRNA 序列解碼為蛋白質(zhì)。tRNA 在翻譯(從 mRNA 分子合成蛋白質(zhì)的過程)期間在核糖體的特定位點發(fā)揮作用。
這三類RNA在每個細(xì)胞中所占的比例各不相同:mRNA約占總RNA的2.0-2.5%,tRNA約占14%,而絕大多數(shù)被rRNA占據(jù)(約80%)。正如您稍后將看到的,這些比例在確定 RNA 提取的質(zhì)量方面起著重要作用。
除了上面列出的 RNA,研究人員還在植物和動物中發(fā)現(xiàn)了許多其他類型的 RNA。
此外,還有一些 RNA 僅對植物具有特異性,例如葉綠體 RNA。
與在線粒體中發(fā)現(xiàn) RNA 的方式類似,葉綠體中也存在 RNA。這些細(xì)胞器(線粒體和葉綠體)中的 RNA 由內(nèi)共生理論解釋。該理論指出,真核細(xì)胞中的線粒體和葉綠體曾經(jīng)是被大型厭氧細(xì)菌攝取的需氧細(xì)菌。因此,植物具有三種*不同的 RNA:核、線粒體和葉綠體。
為什么提取植物RNA這么難?
植物 RNA 的問題在于提取通常會產(chǎn)生較低的 RNA 質(zhì)量和產(chǎn)量。
您可能知道,植物的細(xì)胞中有很多代謝物。它們含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖和次生代謝物,僅舉幾例。
由于裂解步驟,所有這些代謝物在 RNA 提取過程中都變得混合,在此過程中必須破壞植物膜以釋放 RNA。
分離好的 RNA 的困難在于這些代謝物的大量存在。它們在結(jié)構(gòu)上類似于核酸并與 RNA 共沉淀,從而降低了提取的產(chǎn)量和質(zhì)量。此外,氧化多酚(作為醌)等次級代謝物不可逆地與核酸結(jié)合并作為下游應(yīng)用的抑制劑或可能降解 RNA。
使植物 RNA 提取更加困難的其他一些條件包括:許多植物樣品中固有的高水平 RNases(降解 RNA)、低濃度的 RNA(由于含水量高)和纖維組織,如木質(zhì)素(木材) 難以分解和移除。
同樣,分離高質(zhì)量的 RNA 對下游應(yīng)用至關(guān)重要。
植物RNA的應(yīng)用
RNA 在許多不同的技術(shù)中非常有用,可以理解基因調(diào)控和表達(dá)。RNA 用于傳統(tǒng)應(yīng)用,例如:
逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR),
定量 RT-PCR (RT-qPCR)
互補(bǔ) DNA 合成 (cDNA)
Northern印跡
對于高級方法,RNA 用于:
差分顯示 (DD)
抑制消減雜交 (SSH) 文庫構(gòu)建
RNA-Seq(研究特定條件下生物體中存在的所有RNA的轉(zhuǎn)錄組或集合)
染色質(zhì)免疫沉淀
新一代測序 (ChIP-Seq) 實驗。
植物RNA的提取方法
已經(jīng)發(fā)布了數(shù)以千計的植物 RNA 提取方案。但是,大多數(shù)報告的協(xié)議都基于三種方法:
基于苯酚的方法:基于苯酚的方案主要用于具有高濃度次生代謝物的植物。苯酚通常與氯仿結(jié)合以去除多糖污染物。
基于 Trizol 的方法: Trizol 已被用于從特定組織(如擬南芥種子)中提取 RNA 。Trizol 是一種市售試劑,它在單一溶液中結(jié)合了苯酚和異硫氰酸胍,以便在快速分離過程中產(chǎn)生高產(chǎn)量的 RNA。在該方法中,trizol 與氯仿、異丙醇和乙醇在無 RNase 的水中結(jié)合以去除污染物。
基于 CTAB 的方法:十六烷基基溴化銨或基于 CTAB 的方法已用于具有高多糖、次級產(chǎn)物或高水平 RNase 的植物樣品。CTAB 提取緩沖液基本上由 2% 十六烷基基溴化銨、1% 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、100mM Tris-HCl、1.4M NaCl 和 20mM EDTA 組成。這種方法首先去除多糖,然后是蛋白質(zhì),最后是次生代謝物。該方法還可以包括濃度約為 0.5% 的十二烷基硫酸鈉 (SDS)。SDS 是一種去污劑,可與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,有助于在提取過程中去除蛋白質(zhì)污染物。
植物RNA提取的主要步驟
大多數(shù) RNA 提取可以分為四個步驟:
均質(zhì)化:可以新鮮或冷凍獲得組織。此外,當(dāng)沒有合適的實驗室條件時(如從現(xiàn)場工作中收獲),樣品可能會保存在高鹽溶液中,如“RNA 后期試劑"(室溫),直到在實驗室中處理。使用新鮮或冷凍組織沒有一般規(guī)則,因為要求取決于實驗和植物組織。然而,一旦樣品準(zhǔn)備好,它通常被放置在研缽中,并在研杵的幫助下,在加入緩沖提取溶液之前將組織研磨成細(xì)粉。在其他情況下,研究人員可以使用帶有珠子的均質(zhì)器,這有助于將組織粉碎成粉末。
分離:一旦組織變成細(xì)粉,加入緩沖液提取液。在這種情況下,可以使用任何苯酚、trizol 或 CTAB 緩沖液提取溶液。此步驟的目的是裂解細(xì)胞以釋放 RNA。然而,這是關(guān)于污染的關(guān)鍵步驟,因為當(dāng)膜破裂時,所有細(xì)胞內(nèi)容物都會同時釋放。這意味著 RNA 與所有其他細(xì)胞成分結(jié)合,多糖和多酚等代謝物現(xiàn)在可以與 RNA 更緊密地接觸。同時,RNAses 也開始工作,從而增加了 RNA 降解的風(fēng)險。一些提取溶液的作用類似于 RNA 酶抑制劑,可減少 RNA 損傷的機(jī)會。
清除:在此步驟中,使用不同的互補(bǔ)試劑去除污染物,例如多糖、蛋白質(zhì)和次級代謝物,以及其他可能的污染物。氯仿和異丙醇等試劑分別用于去除多糖/二級代謝物和蛋白質(zhì)。此外,污染的基因組 DNA 可以使用基于柱的或基于酶的方法去除。
沉淀:此步驟用于純化和清潔下游應(yīng)用最終溶液中的 RNA,并進(jìn)一步去除任何額外的污染物。在這里,乙醇 70%、用 0.1% (v/v) 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 或無 DNase 和無 RNase 的水處理的水可用于保存提取的 RNA。最后,一旦 RNA 溶解在這些試劑之一中,RNA 必須儲存在 -80°C。
植物RNA提取的關(guān)鍵試劑
盡管在 RNA 中使用了許多解決方案,但在本文中,我們選擇了六種對大多數(shù) RNA 提取協(xié)議非常重要的試劑/解決方案。
裂解緩沖液:這是為了打破細(xì)胞膜并促進(jìn) RNA 的釋放。這通常是 Trizol、苯酚或 CTAB 緩沖液。
氯仿:這是一種通常用于去除多糖的試劑。一些協(xié)議建議使用氯仿進(jìn)行兩次洗滌以獲得更好的結(jié)果。
異丙醇:該試劑有助于去除蛋白質(zhì)。
乙醇:該試劑用于沉淀步驟。通常,RNA 在 70% 乙醇中沉淀。
無 RNase 和 DNase 水:這些用于 RNA 協(xié)議所需的所有解決方案。此外,這種類型的水可以在市場上買到,也可以用 DEPC 處理過的水代替。DEPC 處理過的水是通過將一定體積的蒸餾水與 DEPC 試劑 (0.1% v/v) 混合來制備的。
RNase: RNases 像RN a se A是一種嘧啶特異性酶,可降解胞嘧啶和尿嘧啶殘基處的單鏈 RNA。GoldBio 提供出色的RN a se A,可幫助您進(jìn)行 RNase 保護(hù)分析和 RNA 序列分析。
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