iElisa β-興奮劑檢測試劑盒

1. 概要 β-興奮劑（也稱瘦肉精）主要包括克倫特羅和 沙丁胺醇，是一種腎上腺受體激動劑，即神經(jīng)興奮 劑，化學(xué)性質(zhì)上類似苯乙醇胺的衍生物。此類藥品 在臨床上用于治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎和肺 氣腫等疾病。因該藥可以提高瘦肉率，減少脂肪沉 積和促進(jìn)動物生長，被一些畜牧養(yǎng)殖企業(yè)作為養(yǎng)殖 促進(jìn)劑非法使用。人食用了飼喂 β-興奮劑作為添加 劑的動物所生產(chǎn)的畜產(chǎn)品后，由于畜產(chǎn)品中殘留的 β-興奮劑會引起中毒，通常會出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、 精神緊張、頭疼、肌肉疼痛、暈眩、惡心、嘔吐、 發(fā)燒、顫栗等癥狀，對消費(fèi)者的健康構(gòu)成極大危害。 因此，世界許多國家禁止在飼料中使用 β-興奮劑來 增加動物的瘦肉率。 2. 原理 本產(chǎn)品是利用免疫競爭法檢測原理建立的一 種定量檢測試劑盒。該試劑盒對克倫特羅的交叉反 應(yīng) 100%，對沙丁胺醇的交叉反應(yīng) 110%，所以 β- 興奮劑試劑盒可以對動物組織、飼料和尿液等中克 倫特羅和沙丁胺醇的殘留進(jìn)行定量檢測。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有二抗的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔） 2) 標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/mL 、0.1ng/mL、0.5ng/mL、 2.0ng/mL、5.0ng/mL、20.0 ng/； 1 瓶 × 1.0mL 3) 抗體： 1 瓶 × 10mL 4) 酶標(biāo)抗原： 1 瓶 × 10mL 5) 10×洗滌濃縮液： 1 瓶 × 50mL 6) 10×復(fù)溶濃縮液： 1 瓶 × 16mL 7) 稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50mL 8) 稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50mL 9) 顯色底物： 1 瓶 ×18mL 10) 終止液： 1 瓶 × 7mL 11) 11）試劑盒說明書: 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標(biāo)儀 450nm（iElisa 全自動酶標(biāo)儀或相當(dāng)者） —微量移液器：20μL-200μL 單道，100μL-1000μL 單道, 50μL-300μL 八道 —渦旋混合器 —酶標(biāo)板振蕩器 —多功能旋轉(zhuǎn)振蕩器 —離心機(jī) —氮吹儀 —計時器 —50mL 和 10mL 離心管 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —甲醇 —正己烷 —無水硫酸鈉 —蒸餾水 —鹽酸 —氫氧化鈉 —乙腈 5. 工作溶液的配制 1) 洗滌液的配制： 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的量用純水將 10 倍洗滌濃縮液稀釋 10 倍后使用。（例如：取 10 mL 濃縮液+90 mL 純水, 可以用于 32 孔的 檢測）。 2) 復(fù)溶液的配制（肌肉、肝臟、腎臟樣品用）： 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的量用純水將 10 倍復(fù)溶濃縮液 稀釋 10 倍后使用。（例如：取 2mL 濃縮液+18 mL 純水）。 3) 1.0mol/ L 鹽酸提取液的配制（飼料樣品用）: 取 10mL 濃鹽酸，置于 110mL 純水中，混勻。 4) 0.1mol/ L 氫氧化鈉溶液的配制（飼料樣品用）: 取 4.0g NaOH 加純水定容至 100.0mL。 5) 0.2mol/ L 氫氧化鈉溶液的配制（豬毛樣品用）: 取 8.0g NaOH 加純水定容至 100.0mL。 6. 樣品處理 6.1 尿樣 1) 取尿樣，4000r/min 離心 10min； 2) 取上清液 100μL，用 300μL 稀釋緩沖液 A 稀釋， 混勻、取 50μL 用于檢測。 稀釋倍數(shù)：4。

6.2 肌肉、肝臟、腎臟： 1) 去除肌肉、肝臟或者腎臟中的脂肪部分； 2) 取4.0g均質(zhì)樣品于50mL離心管中，加入8.0mL 乙腈樣品提取液，多功能旋轉(zhuǎn)振蕩器振蕩提取 30 分鐘； 3) 室溫下 4000r/min 離心 10min，移取上清液 4.0mL 到另一試管中，氮吹儀吹干； 4) 用 1.0mL 復(fù)溶液復(fù)溶，向試管中加入 2.0mL 正己烷，渦漩混勻 30 秒，4000r/min 離心 10 分鐘； 5) 取 100μL 下層樣品提取液，用 400μL 稀釋緩沖 液 B 稀釋，混勻、取 50μL 用于檢測。 稀釋倍數(shù)：2.5 6.3 飼料原料 1) 稱取2.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加2.0mL 1.0mol/L 鹽酸提取液及 18mL 純水，混合均勻， 用多功能旋轉(zhuǎn)振蕩器振蕩提取 10min。 2) 4000r/min 離心 10min。 3) 取上清加入 0.1mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 到 7.0-8.0。混合后 4000r/min 離心 10min。 4) 取濾液 200µL，用 200µL 稀釋緩沖液 B 稀釋， 混勻、取 50uL 用于檢測。 稀釋倍數(shù)：22 6.4 復(fù)合飼料 1) 稱取 1.0g 粉碎樣品于 50mL 離心管中，加 10mL 甲醇及 5.0g 無水硫酸鈉，多功能旋轉(zhuǎn)振蕩器振 蕩提取 10 分鐘。 2) 2）4000r/min 離心 10min。 3) 取上清 1.0 mL 于氮吹儀下吹干（50 °C）。 4) 加入 1 mL 水，1.0 mL 正己烷復(fù)溶（渦旋混勻）。 5) 取濾液 200µL，用 200µL 稀釋緩沖液 A 稀釋， 混勻、取 50uL 用于檢測。 稀釋倍數(shù)：20 6.5 豬毛 1) 稱取0.1g粉碎樣品于具塞試管中，加2mL 0.2M 鹽酸提取液，100°C 溫育 10min，多功能旋 轉(zhuǎn)振蕩器振蕩提取 10 分鐘。冷卻至室溫。 2) 將 1mL 提取液轉(zhuǎn)入離心管中，加 10mL 乙酸乙 酯渦旋 30S。 3) 室溫下 3000r/min 離心 5min。 4) 取上清 5.0 mL 于氮吹儀下吹干（40 °C）。 5) 加入 500µL 稀釋緩沖液 A 復(fù)溶。 稀釋倍數(shù)：20 7． 酶聯(lián)免疫分析程序 7.1 測定之前注意事項(xiàng) 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點(diǎn)。 4) 所有溫育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標(biāo)板。 7.2 測定程序 1) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個平行實(shí)驗(yàn)，記錄 下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取50μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別加至相應(yīng)的微孔 （雙孔）中，各微孔中加入50μL 酶標(biāo)抗原， 再各加入50μL抗體，避光，在室溫溫育30min。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入250μL 稀釋好的洗 滌液于酶標(biāo)振蕩器上振蕩30s（或者手工振蕩）， 重復(fù)操作四次，洗完后用力在吸水紙上拍干。 4) 每孔加入150μL顯色底物，室溫避光溫育 10min。 5) 每孔加入50μL 終止液。 6) 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸 光度值（OD值），參比波長630nm。（iElisa全 自動酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。 8. 結(jié)果計算 1) 所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以標(biāo)準(zhǔn)濃度與所獲得的各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)和樣品的平 均百分吸光度值值做 log-logit（B/B0 ）回歸。相對 應(yīng)每一個樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。 2） 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用稀釋后的復(fù)溶液進(jìn)行稀釋。 9. 注意事項(xiàng) 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn) 液的時候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要使用不 同批次的試劑盒，這樣會引起測定誤差。 7) 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。 10. 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 1) 試劑盒靈敏度: 0.1ppb。 2) 試劑盒變異系數(shù)：小于 20%。 3) 試劑盒準(zhǔn)確度：克倫特羅回收率 70％-110％之 間，沙丁胺醇回收率 70％-120％之間。

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