iElisa 黃曲霉毒素總量檢測(cè)試劑盒

iElisa 黃曲霉毒素總量檢測(cè)試劑盒

1. 概要 黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的有毒的代 謝產(chǎn)物，主要存在于谷物、堅(jiān)果和飼料中。1993 年 黃曲霉毒素 B1 被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研 究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類(lèi)致癌物，是一類(lèi)毒性*的劇毒 物質(zhì)。它被證明對(duì)人和動(dòng)物的肝臟、腎臟等組織和 器官具有很大的危害。中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：黃曲霉毒素 B1 在玉米、大米、小麥中*分別不得超過(guò) 20、 10、5μ g/kg，各種飼料中黃曲霉毒素 B1 的*標(biāo) 準(zhǔn)為 10-50μ g/kg。黃曲霉毒素總量試劑盒不僅可以 對(duì)黃曲霉毒素 B1，而且可以對(duì)其他黃曲霉毒素 （B2、G1、G2）進(jìn)行全面的檢測(cè)。 2. 原理 測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有 抗抗體。加入黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、酶標(biāo) 抗原和抗體后，游離的黃曲霉毒素 B1、B2、G1、 G2 與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，抗體或抗體結(jié)合物 與固定在微孔板上的抗抗體再結(jié)合，沒(méi)有結(jié)合的標(biāo) 準(zhǔn)品、酶標(biāo)抗原及抗體被洗去，加入 TMB 底物顯 藍(lán)色，加入終止液后顏色由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀在 450nm 處檢測(cè)，吸光值與樣品中黃曲霉毒素總量含 量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出黃曲霉毒素 總量的含量。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12 條 ×8 孔） 2) AFT 標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/ml、 0.25ng/ml、 0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml 1 瓶 × 1.0ml 3) AFT酶標(biāo)抗原： 1 瓶 × 10ml 4) AFT抗體： 1 瓶 × 10ml 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 6) AFT稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50ml 7) AFT稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50ml 8) 顯色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 9) 終止液： 1 瓶 × 7ml 10) 試劑盒說(shuō)明書(shū)： 1 份 11) 質(zhì)檢報(bào)告： 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標(biāo)儀 450nm（iElisa 全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者） —微量移液器：20μl-200μl 單道，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器） —酶標(biāo)板振蕩器 —渦旋混合器 —氮?dú)獯蹈蓛x —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —離心機(jī) —定性濾紙 —過(guò)濾漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —樣品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 純水，混勻。 —純水（蒸餾水、去離子水）、正己烷、三氯甲烷、 甲醇 5. 樣品處理 5.1 谷物（玉米、小麥、大麥、大米、大豆）： 1） 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2） 將提取液用普通濾紙過(guò)濾，吸取 200μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AFT 稀釋緩沖 液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：12.5 5.2 飼料： 1) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn) 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均 質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2) 將提取液用普通濾紙過(guò)濾，用 0.22μm 有機(jī)系 濾膜過(guò)濾后，取 100μl 濾液置于 1.5ml 離心管中，加入 500ul AFT 稀釋緩沖液 B，用渦旋混 合器混勻。 稀釋倍數(shù)：30 5.3 植物油 1）稱取2.5g油樣品，分別加入10ml正己烷和10mL 樣品提取液（70%甲醇水），劇烈振蕩 3min（用 手或振蕩器），或搖床震蕩 10min。 2） 靜置分層，3000RPM 離心 2 分鐘。吸取 200μl 下層置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AFT 稀 釋緩沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù): 10 倍 5.4 醬油、醋： 1） 取 5.0ml 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 三氯甲烷置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩 10 分 鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上 振蕩 40 分鐘）。 2） 4000 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘，取上層澄清溶液 5ml 與氮 氣吹干儀（60℃）吹干。加入 4ml 70%甲醇水 渦旋混勻 1 分鐘，使其充分復(fù)溶。 3） 吸取 200μl 復(fù)溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AFT 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：10 5.5 糕點(diǎn)： 1） 取 5.0g 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 70% 甲醇水置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩 10 分鐘 （或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上振 蕩 40 分鐘）。 2） 定性濾紙過(guò)濾，取濾液 5ml 加入 10ml 三氯甲烷 渦旋 1min,4000 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘，取下層澄清三 氯甲烷溶液 5ml 與氮?dú)獯蹈蓛x（60℃）吹干。 加入 2ml 70%甲醇水渦旋混勻 1 分鐘，使其充 分復(fù)溶。 3） 吸取 200μl 復(fù)溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AFT 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：10 5.6 酒類(lèi)（白酒、啤酒、威士忌、櫻桃酒、葡萄酒 等） 1) 取 5.0ml 樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 三氯甲烷置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩 10 分 鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或搖床上 振蕩 40 分鐘）。 2) 3000 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘，取上層澄清溶液 5ml 于氮 氣吹干儀（60℃）吹干。加入 5ml 70%甲醇水 渦旋混勻 1 分鐘，使其充分復(fù)溶。 3) 吸取 200μl 復(fù)溶液置于 1.5ml 離心管中，加入 300μl AFT 稀釋緩沖液 A，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數(shù)：12.5 5.7 發(fā)酵液： 1) 吸取 40μl 液體樣品置于 1.5ml 離心管中 2) 加入 960μl AFT 稀釋緩沖液 B，用渦旋混合器 混勻。 稀釋倍數(shù)：25 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 6.1 測(cè)定之前注意事項(xiàng) 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測(cè)定 程序中的要點(diǎn)。 4) 所有溫育過(guò)程應(yīng)避免陽(yáng)光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標(biāo)板。 6.2 溶液的配制 1） 提取液的配制: 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用純水、或蒸餾水、去離子 水） 2） 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍 后使用。（例如：取10 ml 濃縮液+90 ml純水, 可 以用于 32 孔的檢測(cè)）。 6.3 測(cè)定程序 1) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄 下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加至相應(yīng)的微孔 （雙孔）中，然后各加入 50μl 的 AFT 酶標(biāo)抗 原，再加入 50μl 的 AFT 抗體，加蓋，在室溫 溫育 20 分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新 的吸頭）。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μl 稀釋好的洗 滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 4) 每孔加入150μl顯色底物TMB，室溫避光溫育 10分鐘。 5) 每孔加入50μl 終止液。 6) 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測(cè)定吸 光度值（OD值），參比波長(zhǎng)630nm。（iElisa全 自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。7. 結(jié)果判定 1) 所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為 X 軸，百分吸光度值為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對(duì) 應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可 以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算 機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測(cè)定值超出檢測(cè)范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用 70%甲醇進(jìn)行稀釋。 8. 注意事項(xiàng) 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥過(guò)久的情況， 則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn) 液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒，這樣會(huì)引起測(cè)定結(jié)果不 準(zhǔn)確。 7) 試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 試劑盒的性能指標(biāo) 1) 檢測(cè)限 LOD: 谷物 1.5ppb(μg/kg)，飼料 4.0ppb， 植物油 1.5ppb(μg/kg)，醬油、醋 1.5ppb(μg/kg)， 糕點(diǎn) 1.5ppb(μg/kg)，酒類(lèi) 1.5ppb(μg/kg),發(fā)酵液 3.5ppb。（LOD：空白樣品測(cè)定值+2 倍標(biāo)準(zhǔn)偏 差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷物 3.0ppb，飼料 7.5ppb，植物 油 2.5ppb(μg/kg)，醬油、醋 2.5ppb(μg/kg)，糕 點(diǎn) 2.5ppb(μg/kg)，酒類(lèi) 3.0ppb，發(fā)酵液 6ppb。 3) 定量檢測(cè)范圍：谷物3.0-25ppb，飼料7.5-60ppb， 植物油 2.5-20ppb，醬油、醋 2.5-20ppb，糕點(diǎn) 2.5-20ppb，酒類(lèi) 3.0-25ppb,發(fā)酵液 6.0-50ppb。