本文要點(diǎn)：作者設(shè)計(jì)并研制了 D-π-A-π-D 型有機(jī)小分子熒光團(tuán) CED，并將其與 DSPE-mPEG2000 包裹在水溶性納米粒子中，合成了一種明亮的 NIR-II 納米熒光團(tuán)(CED NPs)。CED NPs 可安全、靈敏、快速地用于體內(nèi)熒光成像。近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)

生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，小鼠尾靜脈注射后可立即檢測(cè)到體內(nèi)強(qiáng)熒光信號(hào)。在裸鼠皮下腫瘤模型中，CED NPs 可富集于裸鼠腫瘤部位，并通過血液循環(huán)和 EPR 效應(yīng)呈現(xiàn)腫瘤輪廓。在轉(zhuǎn)移性裸鼠模型中，CED NPs 可標(biāo)記裸鼠受癌細(xì)胞侵襲的淋巴結(jié)，并通過熒光成像指導(dǎo)手術(shù)切除(圖 1)。

圖1. CED NPs制備及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)示意圖

圖2. CED的特性

為了使CED 分子具有更好的生物應(yīng)用，將CED 分子中的醛基與 NH2-PEG 發(fā)生希夫堿反應(yīng)，通過引入 PEG 基團(tuán)提高了 CED 分子的水溶性（圖 2e）。為了避免聚集熒光淬滅和減弱 CED 分子之間的相互作用，CED 被DSPE- mPEG2000 包封，制備成納米顆粒（CED NPs）。通過改進(jìn)和表征 CED 的疏水性，認(rèn)為 CED NPs 的形態(tài)、粒度和水溶性可以滿足下一步實(shí)驗(yàn)的要求。

圖3. CED NPs的熒光特性

在CED NPs水溶液中，通過紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)法測(cè)得CED NPs的zui大吸收峰在725 nm處（圖3a）。CED NPs水溶液的zui大熒光發(fā)射峰可達(dá)1025 nm(圖3b)。圖3c顯示了CED NPs在3種溶液中均表現(xiàn)出良好的熒光穩(wěn)定性。使用 IR-26 作為標(biāo)準(zhǔn)樣品計(jì)算了 CED NPs 的熒光量子產(chǎn)率 (QY)，計(jì)算得到 QYIR-26 =0.50%，QY CED NPs=1.15%。

圖4. CED NPs的細(xì)胞毒性特征

為滿足生物安全要求，采用 MTT 法對(duì) CED NPs 的毒性進(jìn)行表征。檢測(cè)3T3細(xì)胞（圖4a） 929 細(xì)胞（圖4b）和 4T1 癌細(xì)胞(圖4c)的毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CED NPs 對(duì)正常細(xì)胞的毒性略強(qiáng)于癌細(xì)胞，推測(cè)胞吐和癌細(xì)胞的增殖能力可能會(huì)干擾毒性實(shí)驗(yàn)。作者還通過細(xì)胞活力染色實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CED NPs 對(duì)正常細(xì)胞3T3的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示不同濃度下的活細(xì)胞數(shù)差異不大，表明 CED NPs 毒性較小。綜上所述，CED NPs 具有良好的生物安全性，可進(jìn)一步用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

圖5. CED NPs體內(nèi)熒光特性的表征

尾靜脈注射CED NPs后，小鼠體內(nèi)可立即觀察到熒光信號(hào)(圖5a)，在約5分鐘內(nèi)可清楚地觀察到小鼠的主要血管和一些淋巴結(jié)。對(duì)照組注射DSPE-mPEG2000后，成像系統(tǒng)未觀察到熒光(圖 5b)。注射CED NPs 24h后，解剖正常裸鼠，對(duì)主要器官進(jìn)行熒光成像，結(jié)果熒光信號(hào)主要集中在肝臟，在脾臟也有少量信號(hào)，心臟、肺或腎臟中無熒光信號(hào)。通過組織切片可見，CED NPs 注射 24 h 后，裸鼠主要器官未見明顯異常、炎癥或病變。因此，CED NPs 具有良好的生物相容性，且對(duì)裸鼠臟器無損傷。

圖6. 裸鼠轉(zhuǎn)移性腫瘤的熒光特性

為實(shí)現(xiàn)體內(nèi)腫瘤顯像，本研究選擇免疫缺陷的裸鼠為機(jī)體，4T1 細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞來源，建立轉(zhuǎn)移性腫瘤模型。CED NPs 可通過血液循環(huán)被動(dòng)地靶向轉(zhuǎn)移性腫瘤裸鼠中被癌細(xì)胞侵襲的淋巴結(jié)，從而點(diǎn)亮全身更多的淋巴結(jié)。因此，CED NPs 可用于標(biāo)記裸鼠中腫脹的淋巴結(jié)，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移性腫瘤。

在本研究中，作者使用D-A-D結(jié)構(gòu)作為有機(jī)小分子探針的基本骨架，引入EDOT作為受體和供體之間的π-鍵延伸共軛結(jié)構(gòu)，并設(shè)計(jì)和合成了具有更大共軛結(jié)構(gòu)的小分子熒光團(tuán)。為了避免共軛分子之間的相互作用導(dǎo)致熒光猝滅，研究者在共軛分子的主鏈上引入長(zhǎng)鏈烷基作為弱分子間力的屏蔽單元。其次，為了提高CED分子的水溶性，減少聚集熒光的影響，我們用脂質(zhì)體包封了它。CED納米粒子在體內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光特性和生物安全性，可以清晰靈敏地標(biāo)記皮下荷瘤裸鼠的腫瘤位置和輪廓，并可用于標(biāo)記無定向腫瘤裸鼠的腫大淋巴結(jié)，為熒光成像指導(dǎo)臨床手術(shù)提供了清晰的視覺視角。

總之，NIR-II有機(jī)小分子熒光探針是一種非常有前途的造影劑。利用有機(jī)分子結(jié)構(gòu)的易調(diào)諧特性，不斷改進(jìn)小分子探針和供體-受體組合的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)和合成更好的熒光基團(tuán)，加速臨床轉(zhuǎn)化，從而極大地促進(jìn)了醫(yī)學(xué)成像的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

Yuan, L.; Su, Y.; Zhang, R.; Gao, J.; Yu, B.; Cong, H.; Shen, Y., NIR-II organic small molecule probe for labeling lymph nodes and guiding tumor imaging. Talanta 2024, 266.