本文要點(diǎn)：本文報道了一種H2S2介導(dǎo)形成反應(yīng)?；谶@一反應(yīng)，研究者構(gòu)建了第一個NIR-II熒光（FL）和光聲（PA）雙比率探針（NIR-II-H2S2），用于在體內(nèi)可視化定量H2S2。該探針對Na2S2物種顯示出雙比率NIR-II熒光（I840/I1000，107倍）和光聲（PA800/PA900，6.5倍）響應(yīng)，具有高特異性、優(yōu)異的靈敏度（1.8 nM）、改善的水溶性和深層組織滲透性。更重要的是，使用NIR-II雙比率FL/PA成像，成功證明該探針可用于準(zhǔn)確量化脂多糖或二甲雙胍藥物誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型中波動的H2S2水平?？偟膩碚f，這項(xiàng)研究不僅為H2S2相關(guān)的病理研究提供了一種有前景的工具，還提供了一個識別位點(diǎn)，可以推廣到未來設(shè)計更有用的H2S2成像劑。

動物活體成像

方案1. NIR-II FL/PA 雙比率探針NIR-II-H2S2用于定量可視化H2S2基于新發(fā)現(xiàn)的 H2S2-介導(dǎo)的二硫醇形成反應(yīng)。

如方案1所示，NIR-II FL/PA雙比率探針NIR-II-H2S2包含用作信號傳感器的NIR-II花青熒光團(tuán)支架和用作H2S2識別位點(diǎn)的1,3-二氯部分。該探針通過自校準(zhǔn)的雙比率NIR-II FL/PA讀數(shù)顯示出高特異性和敏感性、水溶性和對H2S2的實(shí)質(zhì)性深層組織滲透。這項(xiàng)研究代表了H2S2探針開發(fā)的重大進(jìn)步，因?yàn)橹皥蟮赖腍2Sn探針無法準(zhǔn)確區(qū)分不同的H2Sn物種。此外，利用雙比值NIR-II FL/PA成像，研究者成功證明該探針可以準(zhǔn)確量化脂多糖（LPS）/二甲雙胍（MET）誘導(dǎo)的肝毒性小鼠模型中H2S2水平的波動；H2S2的變化水平與胱硫醚γ-裂解酶（CSE）的變化水平一致?？偟膩碚f，這種NIR-II FL/PA雙比值探針可以為復(fù)雜生物系統(tǒng)中與H2S2相關(guān)的病理研究提供強(qiáng)有力的工具，新發(fā)現(xiàn)的1,3-二氯識別位點(diǎn)可以推廣用于下一代精確H2S2成像劑的設(shè)計。

隨后，為了將探針應(yīng)用于體內(nèi)成像，使用UV/Vis吸收、熒光和PA光譜研究了NIR-II-H2S2對H2S2的雙比率NIR-II FL/PA響應(yīng)。NIR-II-H2S2在PBS/EtOH（7/3，v/v）中的UV/Vis吸收如圖1a所示。隨著H2S2（此處，Na2S2充當(dāng)H2S2的供體）濃度的增加，以900 nm為中心的吸收峰減小，而在800 nm處出現(xiàn)了新的吸收信號。值得注意的是，圖1d中觀察到強(qiáng)烈的線性相關(guān)性，表明NIR-II-H2S2可以作為H2S2的比色探針。此外，測量了不同濃度H2S2的熒光滴定光譜，顯示在1000 nm處的發(fā)射峰降低，在840 nm處出現(xiàn)了一個新的發(fā)射峰（圖1b和1c）。約160nm的大發(fā)射偏移和良好分離的雙發(fā)射帶表明NIR-II-H2S2對H2S2具有優(yōu)異的NIR-II熒光比率響應(yīng)行為。熒光強(qiáng)度比（I840/I1000）提高了約107倍，并與H2S2濃度呈線性關(guān)系（圖1e）。基于熒光比，使用NIR-II-H2S2計算出的H2S2檢測限（3σ/k）約為1.8nM，可以在相對較低的濃度下有效檢測H2S2。

NIR-II-H2S2可用于在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中選擇性地檢測H2S2活性（圖1g）。與吸收光譜中觀察到的變化類似，NIR-II-H2S2探針的光聲光譜在添加Na2S2后逐漸藍(lán)移。比色傳感行為表明，該探針可能實(shí)現(xiàn)H2S2的比率光聲檢測。此外，NIR-II-H2S2溶液的PA成像顯示，用Na2S2滴定時，著Na2S2從0增加到80μM，PA800/PA900幾乎線性地從約0.91±0.02增加到5.91±0.09。此外，PA強(qiáng)度比（PA800/PA900）增加了約6.5倍（圖1f）。NIR-II比率熒光增強(qiáng)（I840/I1000）明顯大于PA比率（PA800/PA90）增強(qiáng)，表明熒光成像的靈敏度可能優(yōu)于PA成像。

此外，體外PA選擇性實(shí)驗(yàn)表明，干擾物種沒有引起PA800/PA900的顯著變化（圖1h），這與熒光選擇性結(jié)果一致（圖1g）。因此，NIR-II-H2S2在雙比率NIR-II FL/PA檢測中表現(xiàn)出優(yōu)異的H2S2特異性。隨后，對添加Na2S2后I840/I1000比值隨時間的變化進(jìn)行跟蹤，結(jié)果表明NIR-II- H2S2與H2S2反應(yīng)迅速，并在8分鐘內(nèi)達(dá)到飽和（圖1i）。此外，還研究了pH值對NIR-II- H2S2與H2S2反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，NIR-II-H2S2適合通過NIR-II FL/PA雙比值模式在體外捕獲H2S2。

實(shí)現(xiàn)足夠的信號穿透一直是體內(nèi)熒光成像的一個挑戰(zhàn)，特別是在研究體內(nèi)深處的生物結(jié)構(gòu)時。為了評估NIR-II- H2S2的組織穿透能力，使用含有NIR-II-H2SO4（NIR-II染料的代表）或Cy-Cl（NIR-I染料的代表）的毛細(xì)管進(jìn)行了脂肪乳劑體模成像，該毛細(xì)管在體模深度浸入1%的脂肪乳劑溶液中，作為組織的模擬（圖2a）。如圖2a所示，即使在7mm的浸沒深度下，NIR-II-H2S2在NIR-II區(qū)域（>1000nm）的管邊界也清晰可辨，而Cy-Cl在NIR-I區(qū)域的管邊界則顯得模糊且無法區(qū)分。NIR-II-H2S2（7mm）的穿透深度幾乎是Cy-Cl（1mm）的七倍。此外，在模擬生物組織的5mm深度處，NIR-II-H2S2的信噪比（SBR）（約11.3）比Cy-Cl（約1.1）高出約十倍（圖2b）。這些結(jié)果表明，NIR-II-H2S2具有更高的成像分辨率和對比度，適用于體內(nèi)深組織成像應(yīng)用。

為了評估NIR-II- H2S2在體外檢測H2S2的潛力，研究者最初在離心管中進(jìn)行了NIR-II FL/PA雙比值成像實(shí)驗(yàn)（圖2). 在沒有Na2S2的情況下，NIR-II-H2S2的NIR-II熒光成像比值在0至30分鐘內(nèi)隨時間變化最小，保持在約1.82±0.05的值（圖2c和2d）。在圖2e和2f中，添加Na2S2后，相應(yīng)的熒光比隨時間從1.81±0.03上升到6.92±0.06，大約增加了3.8倍。同樣，圖2g-2i顯示，NIR-II-H2S2單獨(dú)的PA信號比保持穩(wěn)定在0.92±0.03左右；然而，隨著Na2S2的引入，PA的比例增加了一倍多，上升到2.20。結(jié)果表明，添加Na2S2的試管中NIR-II FL/PA比值發(fā)生了顯著變化，從而證實(shí)了NIR-II-H2S2在體外檢測H2S2的有效性。

圖3. 小鼠腹腔中NIR-II- H2S2 的NIR-II熒光-光聲比率成像

隨后，為了評估NIR-II-H2S2作為檢測外源性H2S2的化學(xué)工具的體內(nèi)檢測能力，將探針和Na2S2注入小鼠腹腔（圖3）。在30分鐘內(nèi)監(jiān)測探針的NIR-II熒光和PA雙比值信號的變化。成像結(jié)果表明，在注射探針和生理鹽水后，NIR-II比率信號強(qiáng)度（I850/I1000）沒有顯示出明顯的變化（圖3a和3d）。相比之下，在注射探針和外源性Na2S2后（圖3b），NIR-II FL信號強(qiáng)度在850 nm處隨著時間的延長而增加，而在1000 nm處觀察到減少，F(xiàn)L強(qiáng)度迅速增加，在20分鐘內(nèi)達(dá)到平穩(wěn)。NIR-II比值信號強(qiáng)度（I850/I1000）從0.83±0.02增加到1.94±0.01，約為2.33倍。此外，比率PA成像顯示了類似的趨勢。作為比較，僅施用探針后，小鼠在兩個通道（PA800和PA900）上的PA強(qiáng)度沒有顯著變化。然而，如圖3e所示，在與Na2S2相互作用后，PA比值信號（PA800/PA900）從0.90±0.02增加到1.51±0.03，大約增強(qiáng)了1.70倍。三維多光譜光聲斷層掃描（3D MSOT）圖像進(jìn)一步證實(shí)，外源性H2S2在小鼠腹腔內(nèi)的相對位置可以在體內(nèi)特異性和直接觀察到（圖3g和3h）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了NIR-II-H2S2可以通過NIR-II-FL/PA雙比值成像在體內(nèi)有效地顯示外源性H2S2的發(fā)現(xiàn)。

圖4. 肝損傷中NIR-II-H2S2 的NIR-II熒光-光聲比率成像

選擇BALB/c裸鼠建立小動物模型，用于鑒定肝損傷期間的H2S2水平。圖4中描繪的小鼠分為五組。最初，三組LPS處理的小鼠腹腔注射不同劑量的LPS以誘導(dǎo)肝損傷（圖4a） 注射生理鹽水和炔丙基甘氨酸（PAG，一種CSE抑制劑）的小鼠分別作為對照組和抑制組。隨后，通過尾靜脈給藥NIR-II-H2S2進(jìn)行體內(nèi)NIR-II-FL比率成像。與對照組相比，LPS治療組的850 nm LP圖像在0至30分鐘內(nèi)肝臟區(qū)域顯示出顯著的NIR-II熒光增強(qiáng)，而1000 nm LP圖像顯示出逐漸減弱。此外，相應(yīng)的NIR-II FL比率測量信號（I850/I1000）在20分鐘（探針富集15分鐘后開始的時間）達(dá)到最大值。20分鐘時獲得的定量數(shù)據(jù)顯示，隨著LPS劑量的增加，肝臟中的I850/I1000比值增加了約2倍，從0.88±0.03增加到1.76±0.02（圖4b、4d-f），表明肝損傷中H2S2水平很高。在PAG抑制組中，觀察到850 nm LP信號的強(qiáng)度降低，NIR-II FL比率信號（I850/I1000）降低到對照組中觀察到的水平（圖4d和4f）。

接下來，在LPS誘導(dǎo)的肝損傷后，使用多光譜光聲斷層掃描（MSOT）系統(tǒng)對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)源性H2S2上調(diào)的NIR-II-H2S2進(jìn)行實(shí)時比率PA成像。PA成像的實(shí)驗(yàn)條件和模型與NIR-II比率FL實(shí)驗(yàn)相同。對20分鐘內(nèi)采集的成像數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析（圖4c，4 g–i）顯示PA800/PA900比值從0.93±0.03急劇增加到1.96±0.08，約為2.11倍。同時還觀察到，在抑制組中，PA比值信號降至對照組的水平。腹腔注射LPS 12小時后，小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）的水平逐漸升高（圖4j和4l）。不同劑量LPS治療前后肝組織切片的H&E染色也顯示，隨著LPS劑量的增加，肝損傷程度相應(yīng)增加（圖4k）。通過血清生物標(biāo)志物檢測和組織學(xué)分析獲得的結(jié)果與體內(nèi)NIR-II FL/PA雙比值成像結(jié)果一致。這些發(fā)現(xiàn)表明，NIR-II-H2S2適用于實(shí)時NIR-II FL/PA雙比值成像，以檢測LPS誘導(dǎo)的肝損傷過程中產(chǎn)生的H2S2，并有望成為研究H2S2相關(guān)病理和治療機(jī)制的有效工具。

圖5. MET誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型和成像實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步評估NIR-II-H2S2在內(nèi)源性H2S2體內(nèi)NIR-II FL/PA雙比值成像中的潛力，建立了MET誘導(dǎo)的肝毒性模型，并將小鼠隨機(jī)分為五組（圖5a）。正如預(yù)期的那樣，靜脈注射NIR-II-H2S2后，實(shí)時NIR-II FL成像顯示，MET治療組在小鼠肝臟區(qū)域的850 nm通道附近顯示出強(qiáng)烈的NIR-II熒光信號，在1000 nm通道處顯示出相對較弱的信號（圖5b）。相比之下，在抑制組中，與MET處理組相比，觀察到850nm通道減少，1000nm通道增加。有趣的是，NIR-II FL比率圖像表明，隨著MET濃度的升高，比率FL信號（I850/I1000）顯著增加，從0.81±0.04增加到1.73±0.06（圖5c），這意味著MET誘導(dǎo)的H2S2生成的檢測非?？煽俊Ｍ瑫r，比率PA成像進(jìn)一步顯示，PA比率（PA800/PA900）從正常小鼠肝臟中的1.00±0.02增加到MET治療組肝臟中的2.21±0.05（圖5d和5h），約為2.21倍。與正常組相比，MET治療的小鼠血清中ALT和AST水平逐漸升高（圖5g和5i），證實(shí)了MET過量引起的不同程度的肝毒性。同時，不同劑量MET治療前后肝組織的H&E染色也表明，隨著MET劑量的增加，肝損傷程度相應(yīng)增加（圖5e）。至關(guān)重要的是，通過血清生物標(biāo)志物檢測或組織學(xué)分析獲得的結(jié)果與FL/PA成像結(jié)果和CSE蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果一致（圖5f）。本研究應(yīng)用NIR-II FL/PA雙比值成像探針闡明H2S2與LPS/MET誘導(dǎo)的肝毒性之間的關(guān)系，從而為H2S2水平的體內(nèi)定量可視化和探索H2S2在炎癥性疾病中的相關(guān)作用提供了有利的分子工具。

總之，基于新發(fā)現(xiàn)的H2S2介導(dǎo)形成反應(yīng)，本文成功構(gòu)建了NIR-II FL/PA雙比值探針NIR-II-H2S2，用于體內(nèi)內(nèi)源性H2S2的定量檢測和可視化。這種反應(yīng)對Na2S2顯示出選擇性，而其他生物RSS（包括GSH、Cys、Hcy、Na2S、Na2S4和S8）則沒有發(fā)生這種反應(yīng)。研究者們設(shè)計的探針NIR-II-H2S2由一個用作信號報告單元的NIR-II熒光團(tuán)支架和一個用作識別位點(diǎn)的新型1,3-二氯部分組成。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，探針NIR-II-H2S2能夠?qū)a2S2物種產(chǎn)生雙比率NIR-II FL（I840/I1000，107倍）和PA（PA800/PA900，6.5倍）反應(yīng)，具有高特異性、優(yōu)異的靈敏度、改善的水溶性和深層組織滲透性。這一進(jìn)展也標(biāo)志著H2S2探針開發(fā)的實(shí)質(zhì)性改進(jìn)，因?yàn)橹皥蟮赖腍2Sn探針無法準(zhǔn)確區(qū)分深部組織中的不同H2Sn物種。此外，憑借NIR-II FL/PA雙比值成像的互補(bǔ)優(yōu)勢，研究者成功地證明了該探針可以精確量化肝損傷小鼠深部肝組織中H2S2水平的波動。目前，這是使用NIR-II FL/PA雙比值探針NIR-II-H2S2闡明H2S2與LPS/MET誘導(dǎo)的肝毒性之間的關(guān)系。因此，本研究為理解H2S2在生命系統(tǒng)中的生物學(xué)功能提供了一種實(shí)用且有前景的工具。新發(fā)現(xiàn)的1,3-二氯識別位點(diǎn)可以促進(jìn)用于各種生物應(yīng)用的下一代H2S2成像劑的設(shè)計。

參考文獻(xiàn)

Hu B, Liu Q, Jiang Y, et al. NIR‐II Fluorescence/Photoacoustic Dual Ratiometric Probes with Unique Recognition Site for Quantitatively Visualizing H2S2 in Vivo[J]. Angewandte Chemie, 2024: e202418378.