ABI7500熱蓋簡(jiǎn)介：
本公司可以大量提供ABI7500/7300這PCR儀全新或維修熱蓋部件（Cover）超長(zhǎng)保修，可安排工程師全國(guó)上門安裝及調(diào)試，*。
現(xiàn)貨供應(yīng)ABI 7500、ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀,,美國(guó)進(jìn)口翻新儀器,一年保修期。
大量現(xiàn)貨低價(jià)供應(yīng)各種進(jìn)口品牌的熒光定量PCR儀。 
ABI7500熱蓋應(yīng)用：
一. 開 機(jī)
1. 確認(rèn)電腦與主機(jī)的數(shù)據(jù)通訊線(灰色USB連線)連接正確。
2. 確認(rèn)電腦處于外接電源供電狀態(tài)。
3. 啟動(dòng)電腦，以Administrator用戶名登錄，進(jìn)入Windows2000操作系統(tǒng)。
4. 待桌面圖標(biāo)出現(xiàn)后，打開7000主機(jī)的電源。
5. 待主機(jī)的電源指示燈點(diǎn)亮后，啟動(dòng)7000 SDS應(yīng)用軟件。
在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，請(qǐng)先檢查樣品加熱模塊以確定它沒有受到熒光污染，具體方法請(qǐng)按照第6節(jié)的“熒光污染的檢查與處理”流程進(jìn)行。
二. 實(shí)時(shí)定量的軟件運(yùn)行
基因表達(dá)的絕對(duì)定量和相對(duì)定量研究、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)(GMO)、各種病原體的檢驗(yàn)檢疫等各種定量應(yīng)用；以CT值的大小作為樣品陰性、陽(yáng)性判定依據(jù)的定性應(yīng)用；以及SNP檢測(cè)、等位基因鑒定實(shí)驗(yàn)等的第一步PCR擴(kuò)增，都是采用實(shí)時(shí)定量模式，按照以下步驟操作。
1. 新建文件 菜單File → New，Assay選擇Absolute Quantification (實(shí)時(shí)定量模式)，打開一個(gè)空白的96孔板文件。

2. 探針設(shè)置 雙擊任意一個(gè)孔，打開Well Inspector窗口。該窗口也可以從菜單View → Well Inspector打開。
3. 使用軟件，或者探針（Detector）沒有設(shè)置好，請(qǐng)點(diǎn)擊Add Detector按鈕，打開Detector Manager窗口。該窗口也可以從菜單Tools → Detector Manager打開。如果Detector列表中沒有合適的探針，點(diǎn)擊按鈕File → New，新建探針：設(shè)定探針的名稱(建議使用所研究基因符號(hào)，如GAPDH、ACTIN等)、報(bào)告基團(tuán)(FAM或者VIC)、淬滅基團(tuán)(TaqMan探針選TAMRA；MGB探針選None)、顏色等。設(shè)置完成后點(diǎn)擊OK，該探針即出現(xiàn)在探針列表中。重復(fù)此過程，設(shè)立其他的探針。
4. 在Detector Manager窗口，從探針列表中點(diǎn)擊選擇所需探針，按住Ctrl鍵可以選擇多個(gè)探針，再點(diǎn)擊Add to Plate Document按鈕。最后點(diǎn)擊Done關(guān)閉Detector Manager窗口。此時(shí)Well Inspector窗口仍然是打開的。
5. 填樣品表 在96孔表中選定有樣品的一個(gè)或多個(gè)孔，在Well Inspector頁(yè)面的Sample Name欄中填入樣品名稱；在探針列表的Use項(xiàng)下的方框中，打鉤選擇要用的一個(gè)或多個(gè)探針；在Task欄中選擇樣品類領(lǐng)：陰性對(duì)照選NTC；未知樣品選Unknown；標(biāo)準(zhǔn)品選Standard。對(duì)于Standard，還要在Quantity欄中輸入DNA拷貝數(shù)。注 意：只有在這里輸入拷貝數(shù)后，軟件才能自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。建議標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在5點(diǎn)以上。建議每個(gè)樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)都按照統(tǒng)計(jì)學(xué)要求作一定數(shù)量的復(fù)管。
6. 參比熒光 如果使用的是ABI公司的定量PCR試劑，如TaqMan Universal PCR Master Mix或者SYBR Green PCR Master Mix等，參比熒光(Passive Reference)選ROX；如果使用的試劑中不含有參比熒光，請(qǐng)選None。完成后點(diǎn)擊右上角的X按鈕，關(guān)閉Well Inspector窗口。
7. 循環(huán)參數(shù) 切換到Instrument頁(yè)面，設(shè)定及修改PCR熱循環(huán)程序：在ABI公司默認(rèn)的程序中，50 C°C 2 C 15°min是UNG酶起作用的步驟，UNG酶可以預(yù)防其他PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物(其中以U代替T)對(duì)定量PCR的污染；95 C 1°10 min是定量PCR的循環(huán)步驟。7000默認(rèn)在最后一步，也就是60°min的作用是激活金牌Taq酶，同時(shí)滅活UNG酶；40個(gè)循環(huán)的95 C 1°sec和60 min復(fù)性和延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。如果使用ABI公司的定量PCR試劑，上述參數(shù)不需要調(diào)整，直接運(yùn)行PCR循環(huán)就可以了。在使用其他廠家試劑的情況下，如果其中沒有UNG酶，請(qǐng)刪除50°C 2 min步驟；如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普通的Taq酶，請(qǐng)刪除95°C 10 min步驟。
8. 循環(huán)參數(shù)的修改方法 刪除：按住Shift鍵并在相應(yīng)的Stage或Step中點(diǎn)擊，該步驟被選中變黑，按Del鍵即可刪該步驟或循環(huán)。插入：在需要插入?yún)?shù)的位置點(diǎn)擊，出現(xiàn)粗黑豎線后，分別點(diǎn)擊Add Hold、Add Cycle或Add Step按鈕添加保溫、循環(huán)或循環(huán)中的一個(gè)步驟。修改溫度和時(shí)間：拖動(dòng)鼠標(biāo)，選中需要修改的溫度或時(shí)間數(shù)字，輸入新的數(shù)值即可。
9. 其他設(shè)置 反應(yīng)體積：定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體積是50 μL；如果想修改的話，建議大于25 μL。融解曲線試驗(yàn)：在Dissociation Protocol選項(xiàng)左邊的方框中打鉤，儀器即在定量PCR循環(huán)完成后繼續(xù)做融解曲線試驗(yàn)。如果是采用SYBR Green I染料方法進(jìn)行定量研究，建議進(jìn)行融解曲線試驗(yàn)，以判定PCR反應(yīng)特異與否。單峰表示單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，多峰表示PCR擴(kuò)增有雜帶。注 意：只有SYBR Green I染料方法才需要進(jìn)行融解曲線試驗(yàn)，TaqMan探針和MGB探針法都不需要。9600 Emulation：選中此項(xiàng)，即可使7000的升降溫速度減慢，與9600和7700一樣，從而可以直接使用在9600、7700型PCR儀上優(yōu)化好的循環(huán)條件，而不需任何修改。
10. 啟動(dòng)擴(kuò)增 點(diǎn)Save按鈕保存文件設(shè)置。確認(rèn)96孔板或全部樣品管在主機(jī)內(nèi)放置妥當(dāng)后，點(diǎn)擊Start按鈕，開始PCR循環(huán)。屏幕上動(dòng)態(tài)顯示PCR進(jìn)程和剩余時(shí)間。
11. 監(jiān)控進(jìn)程 切換到Results頁(yè)面的Amp Plot子頁(yè)面，可以實(shí)時(shí)顯示PCR曲線隨著循環(huán)增加而逐步增長(zhǎng)的實(shí)際情況。如果Detector選FAM或VIC，只顯示對(duì)應(yīng)探針的變化情況；如果選All，則同時(shí)顯示所有探針的反應(yīng)進(jìn)程。
12. 保存結(jié)果 程序結(jié)束后，點(diǎn)Disconnect按鈕，然后File → Save保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢员４鏋?sds格式，也可以保存為.sdt格式，作為以后同類實(shí)驗(yàn)的模板，節(jié)省軟件設(shè)置時(shí)間。
三. 實(shí)時(shí)定量的數(shù)據(jù)分析
1. 數(shù)據(jù)分析 切換到Result頁(yè)面，進(jìn)入擴(kuò)增曲線(Amplification Plot)子頁(yè)面，查看軟件已經(jīng)自動(dòng)分析好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。注 意：此時(shí)的數(shù)據(jù)是軟件根據(jù)默認(rèn)值（基線起點(diǎn)為3，終點(diǎn)為15）得到的初步結(jié)果，還需要根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)的具體情況，精細(xì)調(diào)節(jié)Baseline（基線）的起止點(diǎn)后，重新分析，以得到更精確的數(shù)據(jù)。
2. 基線的起點(diǎn)和終點(diǎn)確定原則 基線(Baseline)是指PCR開始時(shí)信號(hào)很低、接近背景且比較平穩(wěn)的那個(gè)階段。起點(diǎn)要避開開始幾個(gè)循環(huán)由于高溫導(dǎo)致的信號(hào)增高，設(shè)在信號(hào)已經(jīng)降到背景高度且能維持平穩(wěn)的地方，一般在3到6個(gè)循環(huán)之間；終點(diǎn)要避免覆蓋信號(hào)已經(jīng)開始有明顯增長(zhǎng)的地方，一般在本組數(shù)據(jù)中最小的CT值前再3個(gè)循環(huán)處。另外，起點(diǎn)與終點(diǎn)之間最好能間隔8個(gè)循環(huán)以上，以滿足統(tǒng)計(jì)基線標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)學(xué)要求。調(diào)整好起止點(diǎn)以后，再點(diǎn)擊Analyze按鈕，軟件即自動(dòng)計(jì)算新的閾值和CT值，并更新實(shí)驗(yàn)報(bào)告。注 意：此時(shí)擴(kuò)增曲線頁(yè)面上顯示的閾值數(shù)字并不更新，但是這不影響后臺(tái)數(shù)據(jù)運(yùn)算的準(zhǔn)確。
3. 線性圖譜 在默認(rèn)的設(shè)置中，PCR擴(kuò)增曲線圖譜的縱坐標(biāo)代表經(jīng)過ROX和空白校正后的相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表PCR循環(huán)次數(shù)（從1到40）；縱坐標(biāo)以對(duì)數(shù)表示，橫坐標(biāo)以線性表示。如果要看*線性的S形圖譜，請(qǐng)雙擊縱坐標(biāo)軸線，打開坐標(biāo)設(shè)置窗口，將縱坐標(biāo)改成線性形式。
4. 原始數(shù)據(jù) 切換到Component子頁(yè)面，察看原始數(shù)據(jù)。正常的FAM信號(hào)強(qiáng)度，基線時(shí)約為5000點(diǎn)，擴(kuò)增完成達(dá)到約28000點(diǎn)，中間呈S形增長(zhǎng)；TAMRA和ROX的信號(hào)開始時(shí)都比FAM的基線要稍低一點(diǎn)，TAMRA信號(hào)到指數(shù)增長(zhǎng)階段會(huì)降低，而ROX信號(hào)是水平穩(wěn)定的，不隨PCR進(jìn)程而改變，因?yàn)镽OX是以固定濃度加入到PCR試劑中的，它本身并不參與PCR擴(kuò)增。
5. 原始數(shù)據(jù) 切換到Spectra子頁(yè)面，也可以察看原始數(shù)據(jù)。Spectra與Component這兩個(gè)頁(yè)面的區(qū)別是：Component顯示的是信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間(即PCR循環(huán)次數(shù))的變化，是縱向的；而Spectra顯示的是每個(gè)PCR循環(huán)點(diǎn)上信號(hào)強(qiáng)度在不同波長(zhǎng)上的分布，也就是在4個(gè)濾色片上的分布，是橫向的。
6. 標(biāo)準(zhǔn)曲線 切換到Standard Curve子頁(yè)面，察看標(biāo)準(zhǔn)曲線。注 意：只有在Set up時(shí)輸入標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)后，軟件才能自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告 切換到Report子頁(yè)面，察看實(shí)驗(yàn)報(bào)告。確認(rèn)無(wú)誤后，保存結(jié)果。也可以從File菜單中選擇Export，再選擇數(shù)據(jù)類型，輸出各種類型的數(shù)據(jù)，包括CT值、相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度、原始數(shù)據(jù)、融解曲線數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。輸出的數(shù)據(jù)可以用Excel打開，并可在Excel中重新生成擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線等圖譜。
四. 終點(diǎn)讀板的軟件運(yùn)行
各種等位基因鑒定實(shí)驗(yàn)，包括SNP檢測(cè)、基因突變檢測(cè)等，都包括兩個(gè)階段：1、PCR擴(kuò)增；2、擴(kuò)增后的熒光信號(hào)讀取（Post-read）和數(shù)據(jù)處理。第一步既可以在9700、9600等普通的PCR儀上進(jìn)行，也可以在7000、7900等定量PCR儀上進(jìn)行；第二步必須在定量PCR儀上進(jìn)行。以下只敘述第二步Post-Read和數(shù)據(jù)處理的操作方法。如果第一步也在定量PCR儀上進(jìn)行，請(qǐng)按第三節(jié)實(shí)時(shí)定量的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)置和運(yùn)行軟件；待PCR完成、數(shù)據(jù)保存好后，再將同一塊板放在7000上，按以下步驟操作。
1. 新建文件 菜單File → New，Assay選擇Allelic Discrimination (終點(diǎn)讀板模式，用于SNP分析等)，新建一個(gè)空白96孔板文件。
2. 探針設(shè)置 雙擊任意一個(gè)孔，打開Well Inspector窗口。該窗口也可以從菜單View → Well Inspector打開。
3. 使用軟件，或者M(jìn)arker沒有設(shè)置好，先點(diǎn)擊Add Detector按鈕，打開Detector Manager窗口。該窗口也可以從菜單Tools → Detector Manager打開。如果Detector列表中沒有合適的探針，F(xiàn)ile → New，新建探針，設(shè)定探針的名稱(建議使用等位基因的名稱，如Allele 1、Allele 2等)、報(bào)告基團(tuán)(FAM或者VIC)、淬滅基團(tuán)(TaqMan探針選TAMRA；MGB探針選None)、顏色(任意)等。設(shè)置完成后點(diǎn)擊OK，該探針即出現(xiàn)在探針列表中。
4. 位點(diǎn)設(shè)置 Detector設(shè)置好后，點(diǎn)擊Add Marker按鈕，打開Marker Manager窗口。該窗口也可以從菜單Tools → Marker Manager打開。如果在Marker列表中找不到合適的探針，點(diǎn)Create Marker，取名(建議使用位點(diǎn)的名稱，如D2S1356等)，OK，新位點(diǎn)的名字即出現(xiàn)在左邊的位點(diǎn)列表中，選中位點(diǎn)，在右邊的探針列表中打鉤選擇與該位點(diǎn)配套的探針，一般FAM、VIC各一個(gè)組成一套。
5. 選擇位點(diǎn) Marker設(shè)置完成后，在左邊的位點(diǎn)列表中選中該Marker，點(diǎn)擊Copy to Plate Document按鈕，該Marker的信息即分成3行出現(xiàn)在Well Inspector窗口中。重復(fù)選好全部所需Marker，再點(diǎn)擊Done關(guān)閉Marker Manager窗口。注 意：定量PCR實(shí)驗(yàn)只要求設(shè)置探針(Detector)即可，而SNP實(shí)驗(yàn)既要設(shè)置探針(Detector)，還要設(shè)置位點(diǎn)(Marker)。如果沒有設(shè)置Marker，軟件將不能進(jìn)行基因分型。
6. 填樣品表 在96孔表中選定有同類樣品的一個(gè)或多個(gè)孔，在Well Inspector頁(yè)面的Marker列表的Use項(xiàng)下的方框中打鉤，選擇要用的Marker，然后在探針的Task欄選擇樣品類型：陰性對(duì)照選NTC；未知樣品選Unknown。沒有Std。
7. 參比熒光 如果用的是ABI公司的PCR試劑，如TaqMan Universal PCR Master Mix with or without UNG，參比熒光(Passive Reference)選ROX；如果所用試劑中不含ROX參比熒光，請(qǐng)選None。
點(diǎn)擊右上角的X按鈕關(guān)閉Well Inspector窗口。
8. 循環(huán)參數(shù) 切換到Instrument頁(yè)面。PCR熱循環(huán)程序只有60°C一個(gè)步驟，不需要修改。設(shè)置反應(yīng)體積。SNP的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體積是50 μL。點(diǎn)Save按鈕保存文件設(shè)置。
9. 終點(diǎn)讀板 確認(rèn)96孔板或全部樣品管在主機(jī)內(nèi)放置妥當(dāng)后，點(diǎn)擊Post-read按鈕，開始讀取數(shù)據(jù)，大約10秒完成。
10. 保存結(jié)果 程序結(jié)束后點(diǎn)Disconnect按鈕，然后File → Save保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
五. 終點(diǎn)讀板的數(shù)據(jù)分析
1. 數(shù)據(jù)分析 切換到Results頁(yè)面，Allelic discrimination子頁(yè)面，在Marker下拉菜單中選擇要查看其數(shù)據(jù)的Marker，在下面96孔板界面中按Excel方式選擇需要查看的樣品孔，軟件即在中間的圖譜上顯示信號(hào)的分布情況。選擇不同的Marker，顯示不同的信號(hào)。可以點(diǎn)擊放大或縮小工具調(diào)整圖譜的大小。
2. 信號(hào)分布 正常的信號(hào)應(yīng)該分為4組，靠近原點(diǎn)處為NTC；靠近X軸的是VIC信號(hào)，是純合子，其正常信號(hào)強(qiáng)度范圍在2-8之間；靠近Y軸的是FAM信號(hào)，是另一種純合子，其正常信號(hào)強(qiáng)度范圍在4-16之間；靠近對(duì)角線位置的樣品中既有FAM信號(hào)也有VIC信號(hào)，是雜合子，強(qiáng)度為FAM和VIC各自的一半左右。
3. 基因分型 點(diǎn)擊套索工具，然后通過鼠標(biāo)圈定NTC信號(hào)，在Call下拉菜單中選NTC，這些數(shù)據(jù)點(diǎn)即被分型為NTC并顯示相應(yīng)的顏色和圖標(biāo)；同樣分型FAM純合子、VIC純合子和雜合子。
4. 保存結(jié)果 切換到Report頁(yè)面看實(shí)驗(yàn)報(bào)告。確認(rèn)無(wú)誤后，保存分析結(jié)果。也可以從File菜單中選擇Export，再選擇數(shù)據(jù)類型，輸出各種類型的數(shù)據(jù)。
六. 日常維護(hù)
1. 熒光污染的檢查與處理 新建一個(gè)空的96孔板，菜單Instrument → Calibrate打開ROI Inspector窗口，將Exposure Time調(diào)到4096，選定Filter B，點(diǎn)擊Snapshot按鈕（不要?jiǎng)酉旅鎯蓚€(gè)按鈕，以免ROI設(shè)置出錯(cuò)），此時(shí)可以看到排列整齊的96孔圖像。如果觀察到特別明亮的光斑，則表明該孔存在熒光污染。將光標(biāo)移動(dòng)到單個(gè)孔的上方可在右側(cè)欄中的Pixel Intensity處讀出該孔的熒光信號(hào)值，超過500以上的需要清洗。清洗時(shí)盡量使用較細(xì)且無(wú)硬物突出的干棉簽擦拭；如果未能去除，可用去離子水清洗；如污垢頑固，可使用90%乙醇清洗，但要等乙醇*揮發(fā)干凈后方可蓋上熱蓋，以免有機(jī)溶劑損傷熱蓋上的透鏡組。
2. 檢測(cè)器光源的更換流程 關(guān)機(jī)冷卻約15分鐘后，打開儀器頂部蓋板，擰松燈泡保護(hù)罩的螺釘，取下保護(hù)罩，將燈泡拆下，更換新的燈泡并插好連線。注 意：備用的新燈泡必須保存在干燥環(huán)境中。