01.導(dǎo)讀PCR是1984年開始出現(xiàn)的一項(xiàng)基因檢測(cè)技術(shù)，由于PCR技術(shù)具有簡便易行、敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床檢測(cè)，成為分子生物學(xué)必要的研究工具。傳統(tǒng)的PCR定量是應(yīng)用終點(diǎn)PCR來對(duì)樣品中的模板量進(jìn)行定量，通常用凝膠電泳分離，并用熒光染色來檢測(cè)PCR反應(yīng)的終擴(kuò)增產(chǎn)物。但在PCR反應(yīng)中，由于反應(yīng)體系和反應(yīng)條件等因素會(huì)影響PCR反應(yīng)效率,甚至出現(xiàn)一些非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，用終點(diǎn)PCR法來定量并不準(zhǔn)確。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qPCR)是1996年由美國AppliedBiosystems公司推出的一種新的定量技術(shù)，該技術(shù)克服了PCR法進(jìn)入平臺(tái)期后定量的較大誤差問題,實(shí)現(xiàn)DNA/RNA的精確定量，而且具有敏感度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)及臨床醫(yī)學(xué)研究方面都有著重要的意義。
02.基本原理：在PCR反應(yīng)過程中，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),PCR產(chǎn)物量增加.相應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度也跟著增加,此時(shí)收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)。經(jīng)過若干個(gè)循環(huán)后，可以得到一條以循環(huán)數(shù)(cyclethreshold,CT)為橫坐標(biāo)和熒光強(qiáng)度(△Rn)變化為縱坐標(biāo)的“S"形熒光擴(kuò)增曲線。
我們將這條熒光擴(kuò)增曲線人為地分為背景期、指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期三個(gè)階段:
?、俦尘捌冢瑪U(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所覆蓋，我們無法判斷熒光強(qiáng)度的變化。
?、谥笖?shù)擴(kuò)增期，熒光信號(hào)呈指數(shù)增長，擴(kuò)增產(chǎn)物的量與起始模板量存在線性關(guān)系，在此階段可定量分析。
③平臺(tái)期，由于底物耗盡等因素.熒光信號(hào)不再呈指數(shù)增加。
重要的概念：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中有幾個(gè)重要的概念，包括擴(kuò)增曲線、基線、熒光閾值和域值循環(huán)數(shù)。圖片。
?。?）擴(kuò)增曲線（amplificationcurve）:是在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的一條曲線。在進(jìn)行PCR反應(yīng)過程中，通過檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR管內(nèi)的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，將熒光信號(hào)值通過成像技術(shù)顯現(xiàn)在計(jì)算機(jī)上。正常的擴(kuò)增曲線包括四個(gè)階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺(tái)期。
?。?）基線（baseline）：是背景曲線的一段，在擴(kuò)增反應(yīng)的初數(shù)個(gè)循環(huán)里熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線。
?。?）熒光閾值（threshold）:是在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)）。熒光閾值可以設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。
?。?）閾值循環(huán)數(shù):表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多，CT值越小;起始拷貝數(shù)越少,CT值越大。我們利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出以起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),CT值為縱坐標(biāo)的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要獲得未知模板的CT值,即從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該模板的起始拷貝數(shù)。
03.反應(yīng)體系
反應(yīng)體系和條件
?。?）模板濃度與純度:模板的初始濃度越低，結(jié)果的重復(fù)性越差。初始濃度越高，超出了反應(yīng)體系的線性范圍，則需要對(duì)模板進(jìn)行稀釋，否則隨著底物的過早耗盡，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。如果待測(cè)模板的濃度處于PCR反應(yīng)體系的檢出限附近.則需要檢測(cè)雙份以保證結(jié)果的可靠性
?。?）酶及其濃度:TaqDNA聚合酶有兩種，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶：另一種是從大腸埃希菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)需要2.5U的酶。濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
?。?）Mg2+的濃度:Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)物有顯著影響。Mg2+的濃度過高，會(huì)增加引物二聚體的形成；Mg2+的濃度過低，會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性。
