步驟1：擴(kuò)增DNA段，作為焦磷酸測(cè)序模板的單鏈?zhǔn)巧锼貥?biāo)記的。變性后，分離生物素標(biāo)記的單鏈PCR擴(kuò)增子，與測(cè)序引物雜交。雜交的引物和單鏈模板同各種酶一起將檢測(cè)和定量基因突變整合入一個(gè)強(qiáng)有力的體系，使用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，相較于其他基于測(cè)序的方案在分析靶向短鏈DNA序列時(shí)，PyroMark平臺(tái)表現(xiàn)更卓yue。在表觀遺傳學(xué)研究中分析甲基化狀態(tài)，焦磷酸測(cè)序技術(shù)可高重復(fù)性的定量甲基化頻率，包括單個(gè)或連續(xù)的CpG位點(diǎn)，并可檢測(cè)和定量甲基化水平的微小變化。

對(duì)于遺傳檢測(cè)應(yīng)用，焦磷酸測(cè)序技術(shù)可準(zhǔn)確定量等位基因的可變位點(diǎn)，且很容易解決雜合性問題。 對(duì)于微生物鑒定和抗性分型，焦磷酸測(cè)序技術(shù)能夠同時(shí)分析多個(gè)樣本的常見的藥物抗性突變的。

原理

焦磷酸測(cè)序技術(shù)基于邊合成邊測(cè)序的原理，數(shù)分鐘內(nèi)可獲得定量數(shù)據(jù)。PyroMark Q96 ID是提供實(shí)時(shí)序列信息的完整體系，高度適用于檢測(cè)遺傳變異、遺傳定量和短鏈DNA測(cè)序。以下的產(chǎn)品可配合PyroMark Q96 ID儀器使用：PyroMark Q96 Vacuum Workstation、PyroMark CpG SW、PyroMark Assay Design SW、PyroMark IdentiFire SW、PyroMark Gold Q96 Reagents和PyroMark Control Oligo。同時(shí)提供樣本制備方案，可使用PyroMark Q96 Vacuum Workstation制備單鏈DNA。

焦磷酸測(cè)序反應(yīng)步驟：

孵育，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶以及底物腺苷酰硫酸（APS）和熒光素。

步驟2：脫氧核苷三磷酸（dNTP）加入反應(yīng)中，在DNA聚合酶的作用下，dNTP結(jié)合到DNA鏈上與其互補(bǔ)的堿基位。每次結(jié)合都會(huì)釋放與核苷酸相等摩爾量的焦磷酸（PPi）。

步驟3：在有APS的條件下，ATP硫酸化酶將PPi轉(zhuǎn)化為ATP。在這個(gè)ATP的驅(qū)動(dòng)下，熒光素酶將熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素，并產(chǎn)生可見光，可見光的量與ATP的量成正比。通過電荷耦合（CCD）相機(jī)即可檢測(cè)到熒光素酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的可見光，并在原始數(shù)據(jù)輸出（Pyrogram）中顯示為一個(gè)峰，每個(gè)峰的高度（光信號(hào)）與結(jié)合的核苷酸數(shù)量成正比。

步驟4：三磷酸腺苷雙磷酸酶，是一種核苷酸降解酶，會(huì)降解未結(jié)合的核苷酸與ATP。*降解后，加入另一個(gè)核苷酸。

步驟5：持續(xù)添加dNTP。α-硫代脫氧腺苷三磷酸（dATPαS）在反應(yīng)中用于替代天然脫氧腺苷三磷酸（dATP），這是因?yàn)镈NA聚合酶可高效的應(yīng)用前者，而不被熒光素酶識(shí)別。當(dāng)該過程連續(xù)進(jìn)行時(shí)，就會(huì)形成互補(bǔ)的DNA鏈，可根據(jù)Pyrogram追蹤的信號(hào)峰確定核苷酸序列。

簡(jiǎn)化的工作流程—從樣本到結(jié)果

多功能PyroMark Q96 ID與表觀遺傳和遺傳分析流程無縫接合，且與QIAGEN良好的樣本制備、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和PCR擴(kuò)增技術(shù)兼容。借助于高度可靠的儀器可在序列水平上對(duì)SNP、插入和缺失、CpG位點(diǎn)的檢測(cè)以及生成序列信息。簡(jiǎn)化的工作流程可更快速地獲得結(jié)果。

快速方便的樣本制備

從PCR產(chǎn)物到直接用于測(cè)序的單鏈模板，應(yīng)用PyroMark Q96 Vacuum Workstation可在15分鐘內(nèi)同時(shí)制備96個(gè)樣本。該工作站操作簡(jiǎn)單，且手工操作時(shí)間少于5分鐘。

流程

快速方便的樣本制備

從PCR產(chǎn)物到直接用于測(cè)序的單鏈模板，應(yīng)用PyroMark Q96 Vacuum Workstation可在15分鐘內(nèi)同時(shí)制備96個(gè)樣本。該工作站操作簡(jiǎn)單，且手工操作時(shí)間少于5分鐘。

在焦磷酸測(cè)序之前，形成了一個(gè)生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物結(jié)合到覆蓋鏈酶親和素的瓊脂糖凝膠珠上。這些膠珠會(huì)被真空儀器捕捉并*清洗，隨后變性，得到適合于焦磷酸測(cè)序的單鏈DNA。該模板DNA放入含測(cè)序引物的焦磷酸測(cè)序反應(yīng)板中，隨后引物退火，再將該板放入PyroMark儀器中即可。PyroMark Gold試劑包含用于焦磷酸測(cè)序反應(yīng)的酶、核苷酸和底物，將這些試劑移入分配卡夾，按照軟件中提供的體積試被加入儀器中，用于焦磷酸測(cè)序。