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當前位置:上海翼和應用生物技術(shù)有限公司>>試劑盒>>端粒酶活性檢測試劑盒>> BPT50端粒酶活性檢測試劑盒
BPT50
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上海市
更新時間:2024-03-27 09:54:10瀏覽次數(shù):1873次
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【產(chǎn)品規(guī)格】
BPT50 50T(50人份,分五個**包裝)
【產(chǎn)品說明】
端粒酶活性檢測試劑盒(Telomerase)是一種酶促核糖**白復合物。其催化亞基(TERT)具有逆轉(zhuǎn)錄酶的特性,TERT被認為是端粒酶活性表達的關(guān)鍵組分,其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致,與端粒酶的活化程度密切相關(guān)。因此,對端粒酶催化亞基的檢測可以間接反映樣本中端粒酶活性。
本產(chǎn)品試劑KIT采用雙色熒光qPCR(TaqMan探針法)檢測端粒酶催化亞基TERT基因和內(nèi)參基因***DH。通過提取細胞RNA,利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應,以cDNA為模板在單管中利用多重熒光定量PCR進行擴增反應(雙重探針:FAM、Cy5)。選用293T細胞為陽性對照以及MRC-5細胞為陰性對照,通過??CT法檢測樣本中TERT基因的相對表達量。該試劑KIT具有以下特點:
1. 靈敏:雙色探針,靈敏度高。
2. 穩(wěn)定:全程閉管操作,無交叉污染。
3. 可靠:含內(nèi)參基因,避免假陰性。
4. 方便:操作簡單,無需電泳步驟。
5. 定量:以CT值判斷,可定量檢測。
【端粒酶活性檢測試劑盒運輸及保存條件】
低溫冷凍運輸,避光-20℃保存,保質(zhì)期6個月。開蓋后,4℃保存,保質(zhì)期1周。
【產(chǎn)品組分】
注:1.本試劑盒提供試劑,使用前先低速離心、后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻,避免起 泡,并低速短暫離心后使用;
2.為了避免反復凍融,10 人份/管作為一個包裝。
【操作步驟】
1. 逆轉(zhuǎn)錄反應
使用Trizol法抽提細胞RNA,RNA純度A260/280在1.9-2.0之間。取1ug RNA使用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑KIT(貨號:K1622),將試劑KIT中的Random Primer替換成Biowing®Specific Reverse Transcription Primers進行反轉(zhuǎn)錄反應得到cDNA。
1.1 DNase I處理
反應程序:37℃ 30min;加EDTA 1 µL 后,65℃,10min
1.2 逆轉(zhuǎn)錄反應
反應程序:20℃ 10min;42℃ 1h;72℃ 5min
2. qPCR反應體系及條件
2.1 陽性對照處理
將陽性對照cDNA進行2倍、4倍的梯度稀釋,每個梯度建議三重復。
2.2 陰性對照處理
將陰性對照cDNA進行2倍、4倍的梯度稀釋,每個梯度建議三重復。
2.3 樣本處理
將待測樣本cDNA進行2倍稀釋作為測試濃度,每個樣本做三重復。
反應體系(以20µL為例)
PCR儀設置(以ABI 7500為例)
【基線設置】(以ABI 7500為例)
一般默認起始和終止基線位置為3-15個循環(huán),應根據(jù)內(nèi)參基因和TERT基因?qū)嶋H擴增曲線手動將基線起始循環(huán)數(shù)調(diào)整為指數(shù)增長期之前即可。
【閾值設置】(以ABI 7500為例)
內(nèi)參閾值設定:以陽性對照2倍稀釋cDNA定內(nèi)參基因擴增曲線閾值,內(nèi)參基因(Cy5)初始濃度的CT值定為16±3;
TERT閾值設定:以陽性對照2倍稀釋cDNA定TERT基因擴增曲線閾值,TERT基因(FAM)初始濃度CT值的定為25±3。
【結(jié)果判讀】
圖1 左:陽性293T細胞的擴增曲線;右:陰性MRC-5細胞的擴增曲線
(藍色為TERT基因曲線,黃綠色為內(nèi)參基因曲線)
1. 陽性對照2倍稀釋后TERT基因Ct值在 25±3,內(nèi)參基因Ct值在16±3,4倍稀釋后TERT基因Ct值 在26±3,內(nèi)參基因Ct值在17±3。
TERT基因和內(nèi)參基因之間?CT維持在9±3,保持穩(wěn)定。
2. 陰性對照經(jīng)2倍、4倍梯度稀釋后,TERT基因Ct值≥35(或檢測不到),內(nèi)參基因Ct值仍在13-20之間,判定為端粒酶活性為陰性。
3. 結(jié)果說明
若待測樣本內(nèi)參基因Ct值在13-19之間,TERT基因Ct值<35且擴增曲線正常,則樣本端粒酶活性為陽性。
若待測樣本內(nèi)參基因Ct值在13-19之間,TERT基因Ct值≥35且無明顯的擴增曲線則樣本無端粒酶活性。
【說明】
1. 待測樣本cDNA 2倍稀釋作為模板,三次技術(shù)重復,不設置梯度稀釋;陽性對照、陰性對照進行2倍、4倍梯度稀釋,建議分別做三重復;避免偶然誤差的產(chǎn)生。
2. 如果陽性/陰性對照2倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值>19,表明參考品有降解或者試劑盒擴增效率下降。
3. 如果所有樣本2倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值>19,表明試劑盒的擴增效率下降。
4. 如果陽性對照2倍稀釋后TERT基因Ct值>28,表明TERT基因檢測系統(tǒng)失效。
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