羅氏潮霉素B

潮霉素B作用機(jī)制：

        潮霉素B是由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，通過抑制蛋白質(zhì)合成而殺死細(xì)菌、真菌和高等真核細(xì)胞。潮霉素B通過干擾70S核糖體易位和誘導(dǎo)對mRNA模板的錯讀而抑制蛋白合成。目前常用于篩選和維持培養(yǎng)含潮霉素抗性基因的原核或真核細(xì)胞。 
抗性基因： 
對潮霉素B的抗性源自編碼潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（Hph）的基因。至今發(fā)現(xiàn)兩種來源： 
Streptomyces hygroscopicus產(chǎn)生的Hph抗性基因；
Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae內(nèi)質(zhì)粒攜帶的Hph抗性基因（常用）；  
羅氏潮霉素B生物應(yīng)用： 
1） 篩選和維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hph 載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞（植物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞）； 
2）由于作用模式的差異，常與G418 （GeneticinTM），Zeocin™和blasticidin S聯(lián)合使用，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩個不同載體的細(xì)胞株；
3）抗病毒劑，由于潮霉素B選擇性滲透進(jìn)入因為病毒感染增強通透性的細(xì)胞，而且具有抑制翻譯的功效；
4）作為驅(qū)蟲藥加入動物飼料； 
雙抗性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選的抗生素作用機(jī)制及抗性
抗生素抗性機(jī)制抗性基因哺乳動物篩選濃度
潮霉素B干擾70S核糖體易位和誘導(dǎo)對mRNA模板的錯讀Hph200~500μg/mL
G418干擾80S核糖體功能和抑制蛋白合成Tn5/Tn601100~1000μg/mL
Zeocin摻入或者切割DNA引起細(xì)胞死亡Sh ble50~100μg/mL
blasticidin S核糖體上抑制肽鍵形成Bsd/BSD3~50μg/mL

 
羅氏潮霉素B應(yīng)用濃度： 
潮霉素B用來篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類型，培養(yǎng)基，生長條件和細(xì)胞代謝率而變化。推薦使用濃度為50-1000 μg/mL，濃度需要殺滅曲線來確定。 
哺乳動物細(xì)胞·200-500 μg/mL；細(xì)菌/植物細(xì)胞·100-300 μg/mL；真菌·300-1000μg/mL； 
 
羅氏潮霉素B產(chǎn)品使用：
使用一：殺滅曲線確定佳殺死濃度（僅作參考，因個人檢測體系而異）
（1）往組織培養(yǎng)級的96孔板內(nèi)加入未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞密度約50-200細(xì)胞/孔；細(xì)胞貼壁之后，往每孔加入含不同濃度（如50-1000μg/mL，至少5個濃度）潮霉素B的200μL新鮮培養(yǎng)基；
（2）37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞10-14天；
（3）培養(yǎng)5-7天后更換新的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液內(nèi)含有相應(yīng)濃度的潮霉素B；
（4）10-14天后使用細(xì)胞增殖方法如MTT，CCK-8等評估細(xì)胞活力；也可以通過檢測細(xì)胞克隆數(shù)或百分比匯合率來確定毒性效應(yīng)。一般選擇在10-14天能夠殺死所有細(xì)胞的小濃度為佳篩選濃度。
使用二：篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞
（1）對于貼壁細(xì)胞，直接吸去60mm培養(yǎng)皿內(nèi)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基，然后加入含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基5-6ml；對于懸浮細(xì)胞，無菌條件250x g,離心10min除去舊的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基，然后懸浮在約5ml的含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基；
（2） 5-7天后，如上方法更換含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基；
（3） 再孵育細(xì)胞5-7天；
（4） 10-14天孵育后，培養(yǎng)體系中只含有能夠表達(dá)潮霉素B抗性表型的活細(xì)胞。因此篩選之后如步驟一，更換不含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基。