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ELISA空白背景高的常見原因和處理方法

閱讀:2188      發(fā)布時(shí)間:2023-11-13
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ELISA素來以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。而它作為經(jīng)典的免疫檢測(cè)方法,雖然看似平常但是要真正將該實(shí)驗(yàn)做好并不容易,酶標(biāo)板的讀值總是會(huì)不盡如人意,可見實(shí)操中的各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)該實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)效果影響較大,如不注意,就會(huì)產(chǎn)生一些糟心的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。跟小源一起來總結(jié)一下ELISA空白背景高的常見原因和處理方法吧!

常見原因有以下這些:

1)洗板不干凈

解決方法:

①充分洗滌:如果洗板的時(shí)間不夠,會(huì)導(dǎo)致抗體殘留,陰性對(duì)照會(huì)顯色,嘗試延長(zhǎng)洗板時(shí)間,增加洗板頻率,在洗液中添加表面活性劑Tween-20。

在洗板時(shí)要保證每步都洗滌,充分拍板直至孔內(nèi)沒有明顯的殘留液體。

②避免交叉污染:棄去洗液和孵育的抗體時(shí)避免交叉污染,移液槍頭盡可能一次性使用,拍板的濾紙不要反復(fù)使用。

2)顯色液變質(zhì)或者試劑過期

解決方法:檢查試劑盒有效期,或使用新的試劑盒并按照說明書要求保存試劑盒。每次用剩下的顯色液最好不要回收,或者只回收洗凈的容器裝的顯色液。

3)試劑稀釋有誤,檢測(cè)抗體/酶結(jié)合物工作液濃度過高

解決方法:按照說明書推薦的稀釋倍數(shù)稀釋抗體。

4)試劑盒組分未平衡

解決方法:試劑盒每個(gè)組分都需要平衡至室溫后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

5)混用其他試劑盒試劑

解決方法:保證使用試劑盒內(nèi)完整的一套試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn),不同品牌及不同批次間的試劑可能存在不匹配現(xiàn)象,不同批號(hào)的試劑不要混用。

6)蒸餾水受酶等污染

解決方法:使用新鮮蒸餾水。

7)培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)

解決方法:孵育時(shí)間過長(zhǎng)、溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加,從而造成本底增高。檢查恒溫箱,確保孵育溫度穩(wěn)定在37℃,按照說明書的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行孵育。

8)酶標(biāo)板底部有污漬

解決方法:在加完終止液之后,檢測(cè)之前,用75%乙醇浸潤(rùn)的脫脂棉球擦拭酶標(biāo)板底部,確認(rèn)沒有污漬之后再檢測(cè)。

9)洗液被污染

解決方法:洗液現(xiàn)配現(xiàn)用,長(zhǎng)期放置會(huì)析出,也可能會(huì)污染,導(dǎo)致背景偏高。

10)包被的抗原被污染

解決辦法:仔細(xì)回想操作過程,換新的抗原包被。

11)封閉液、封閉時(shí)間、封閉液的濃度

解決辦法:封閉液(BSA)可能會(huì)與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。封閉液的濃度偏低、封閉時(shí)間過短導(dǎo)致封閉不che底,抗體與酶標(biāo)板結(jié)合,可能也會(huì)導(dǎo)致背景偏高,因此可以適當(dāng)調(diào)整封閉液的濃度和時(shí)間以降低背景。

12)抗體質(zhì)量差或選擇的抗體不合適

解決辦法:抗體質(zhì)量不高,特異性不好可能會(huì)與封閉液(BSA)產(chǎn)生交叉反應(yīng),可以用0.8%明膠(明膠不含有血清成分)代替。

若選擇多克隆抗體孵育,可能會(huì)與酶標(biāo)單抗產(chǎn)生交叉反應(yīng),導(dǎo)致背景增加,最好選用與酶標(biāo)單抗同種屬的多克隆抗體。

13)酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù)有誤

解決辦法:檢查酶標(biāo)儀設(shè)置的波長(zhǎng),不同波長(zhǎng)下樣品的吸光光度值也會(huì)有很大的差別,按照說明書要求設(shè)置參數(shù)。

本期內(nèi)容:ELISA空白背景高的常見原因和處理方法

下期內(nèi)容:酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA實(shí)驗(yàn)類型有哪些?


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