磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC)試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

PEPC（EC 4.1.1.31）廣泛存在于動物、植物、微生物和細胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應生成草酰乙酸呈不可逆反應的酶，對三羧酸循環(huán)的運轉起重要調節(jié)作用。

測定原理：

PEPC 催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO2 生成草酰乙酸和HPO4^2-，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和 NADH 生成蘋果酸和NAD⁺，在 340nm 測定NADH 減少速率，計算PEPC 活性。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶試劑盒 糖代謝系列

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟和加樣表：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

（1） 取試劑二瓶一瓶，加入 6ml 試劑一和 4.2ml 蒸餾水充分混勻，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；現配現用。

（2） 試劑三工作液的配制：將試劑三原液：試劑三稀釋液=1μl:329μl 稀釋，混勻，用多少配多少。

（3） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、20μl 試劑三、170μl 試劑二，混勻，立即記錄 340nm處 20s 時的吸光值A1 和 5min20s 后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

PEPC 活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）PEPC 活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=643×ΔA 2、組織、細菌或細胞中 PEPC 活力計算

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=643×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=1.286×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）PEPC 活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=1286×ΔA 2、組織、細菌或細胞中 PEPC 活力計算

（1） 按樣本蛋白濃度計算

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單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=1286×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每 1 萬個細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=2.572×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

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