蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性指的是蛋白質(zhì)抵抗各種因素的影響，保持其生物活力的能力。蛋白質(zhì)在細(xì)胞和生物體的生命活動(dòng)過(guò)程中，起著十分重要的作用。從生物的構(gòu)成到生物的新陳代謝、遺傳都和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。生物的結(jié)構(gòu)和性狀都與蛋白質(zhì)有關(guān)。因此，合適的表征手段對(duì)研究蛋白質(zhì)變性至關(guān)重要。

一、蛋白質(zhì)失活的原因和機(jī)理：

1蛋白水解酶和自溶作用

    1.1酶在使用和貯存過(guò)程中的失活常是由于微生物和外源蛋白水解酶作用的結(jié)果。蛋白水解酶可催化肽鍵水解。

    1.2 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)底物也是一種蛋白水解酶時(shí)，就會(huì)發(fā)生自我降解現(xiàn)象，叫做自溶。

2 聚合作用

蛋白質(zhì)發(fā)生可逆性伸展——>伸展的蛋白質(zhì)分子彼此締合——>可能發(fā)生蛋白質(zhì)分子間二硫鍵的形成從而使蛋白質(zhì)沉淀析出。蛋白質(zhì)的聚合作用和沉淀的區(qū)別：蛋白質(zhì)的聚合作用可能是可逆的，并不一定是不可逆的。沉淀作用意味著蛋白質(zhì)并未發(fā)生顯著的構(gòu)象變化即從溶液中析出。因此沉淀很容易再溶于水溶液宏，并恢復(fù)其全部天然特性。

3 pH

pH下引起蛋白質(zhì)變性的重要因素是：一旦遠(yuǎn)離了蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，那么蛋白質(zhì)分子內(nèi)相同電荷間的靜電斥力會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展。從而使埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部非電離殘基發(fā)生電離，導(dǎo)致失活。pH的變化可以引起蛋白質(zhì)的伸展，這個(gè)過(guò)程原則上是可逆的，但這些變化常能導(dǎo)致不可逆的聚合或酶的自溶，引起不可逆失活。

4 氧化作用

各種氧化劑能氧化帶芳香族側(cè)鏈的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基，從而使蛋白質(zhì)變性。分子氧，H2O2和氧自由基是常見的蛋白質(zhì)氧化劑。

5 表面活性劑和去污劑

表面活性劑在很低濃度下能使蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈地相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不可逆變性。其中陰離子去污劑的作用比陽(yáng)離子和非離子去污劑強(qiáng)烈。

6 變性劑

    6.1脲和鹽酸胍：機(jī)制尚不明確，可能是消除了維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的疏水作用力或直接與蛋白質(zhì)分子作用

    6.2高濃度鹽：高濃度鹽既有穩(wěn)定作用也有變性作用，這要看鹽的性質(zhì)和濃度。

    6.3螯合：常常不可逆地失活需要金屬輔因子的酶，但可穩(wěn)定不需要金屬輔因子的酶。

    6.4有機(jī)溶劑改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)；增加疏水核的溶解度，降低帶電表面的溶解度；奪去酶分子表面的必須水而使酶失活。

7 重金屬離子和疏基試劑

與蛋白質(zhì)的疏基、二硫鍵以及色氨酸、組氨酸殘基反應(yīng)。

8 熱

熱失活是溶液上經(jīng)常遇到的酶失活的原因。熱失活分兩部分：伸展---不可逆失活。

9 機(jī)械力

振動(dòng)、剪切、超聲波、壓力都可能引起蛋白質(zhì)的變性。這種變性理論上是可逆的，但也伴隨著其他反應(yīng)而不可逆地失活。

10 冷凍和脫水

冷凍和脫水時(shí)，溶質(zhì)被濃縮，引起酶微環(huán)境中pH和離子強(qiáng)度的劇烈改變，減弱疏水相互作用，并可能引起二硫交換和疏基的氧化。

11 輻射作用：

輻射可產(chǎn)生自由基（·OH,H2O2,O2-等）直接或間接地作用于蛋白質(zhì)分子。

二、蛋白質(zhì)失活的研究方法

案例1 組氨酸對(duì)蛋白的保護(hù)作用

Turbiscan多重光散射儀（靜態(tài)多重光散射）

用Turbiscan多重光散射儀測(cè)量高濃度蛋白溶液中的平均粒徑來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的聚集。該技術(shù)分析了蛋白質(zhì)的自然形態(tài)與時(shí)間的關(guān)系，且無(wú)需稀釋。10 wt%濃度的牛血清白蛋白蛋白（BSA）分散于水中，在60℃下分析20h。

蛋白粒徑與組氨酸含量的關(guān)系（左：粒徑vs時(shí)間 右：粒徑@20hvs組氨酸濃度）

討論：增加組氨酸濃度可使蛋白直徑保持較低且更接近其原始狀態(tài)而不發(fā)生變性。多重光散射技術(shù)測(cè)量過(guò)程無(wú)需稀釋，可以在原位狀態(tài)下表征蛋白質(zhì)的聚集變性過(guò)程，是比較科學(xué)的研究失穩(wěn)過(guò)程的方法。

案例2 輻射對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響

2018年Chengliang Li等學(xué)者利用Turbscan(靜態(tài)多重光散射)研究了輻射對(duì)SP肌漿蛋白和MP肌肉蛋白的物理穩(wěn)定性的影響。不同輻照劑量0, 3, 5 and 7 kGy的TSI不穩(wěn)定性指數(shù)在3h內(nèi)的變化曲線如下圖所示。

TSI穩(wěn)定性指數(shù)隨時(shí)間變化關(guān)系（左:MP肌肉蛋白 右：SP肌漿蛋白）

為了表征蛋白質(zhì)失穩(wěn)過(guò)程的彈性和粘性性變化，Chengliang Li利用Rheolaser Master(動(dòng)態(tài)多重光散射)評(píng)價(jià)了不同輻射劑量蛋白的微流變性。

Rheolaser Master光學(xué)法微流變儀

微流變性隨時(shí)間變化關(guān)系（A MP肌肉蛋白彈性 B SP肌漿蛋白彈性 C MP肌肉蛋白粘性 D SP肌漿蛋白粘性）

討論：對(duì)于MP肌肉蛋白而言，輻射劑量≥5kgy時(shí)的TSI高于輻射劑量3kgy的TSI，但是差距不大，MP的物理穩(wěn)定性隨輻射劑量變化不明顯。這與微流變數(shù)據(jù)(A和C)有比較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。另外，與SP對(duì)照組相比，輻射后的SP樣品的TSI顯著升高，說(shuō)明SP可能聚集并形成蛋白質(zhì)聚合物

Li C , He L , Ma S , et al. Effect of irradiation modification on conformation and gelation properties of pork myofibrillar and sarcoplasmic protein[J]. Food Hydrocolloids, 2018, 84(NOV.):181-192.

案例3 Rheolaser Crystal表征BSA蛋白的熱穩(wěn)定性

Rheolaser Crystal相變分析儀

熱分析是表征蛋白熱穩(wěn)定性的基本方法之一，多年以來(lái)一直廣泛應(yīng)用于科研和工業(yè)中。近年來(lái)在各個(gè)領(lǐng)域，特別是高分子材料領(lǐng)域，都有了長(zhǎng)足發(fā)展。差示掃描量熱法（DSC）是應(yīng)用廣泛的熱分析技術(shù)之一。相變分析儀（Rheolaser Crystal）與DSC應(yīng)用方向類似，可以表征蛋白質(zhì)的凝膠點(diǎn)，但是由于相變分析儀采用DWS技術(shù)，直接從顆粒的納米級(jí)運(yùn)動(dòng)速度獲取數(shù)據(jù)，因此對(duì)于結(jié)構(gòu)變化具有更加靈敏的相應(yīng)。

蛋白受熱變性性示意圖

下圖展示了用Rheolaser Crystal與DSC測(cè)量的2%BSA pH 4, 15mM NaCl水溶液的凝膠點(diǎn)。

BSA蛋白的在升溫過(guò)程中的凝膠點(diǎn)（藍(lán)色：相變分析儀數(shù)據(jù) 黑色：DSC數(shù)據(jù)）

討論：兩個(gè)測(cè)試技術(shù)的凝膠點(diǎn)基本一致。DSC由于基線并不平整，熱的流量曲線在凝膠點(diǎn)附近出現(xiàn)的峰比較小，容易被忽略。而Rheolaser Crystal的峰非常清晰明了地指示了BSA的凝膠點(diǎn)，由于測(cè)量方法的優(yōu)勢(shì)，Rheolaser Crystal不需要考慮樣品的狀態(tài)固體，粉末，液體，對(duì)樣品制樣要求不高，樣品量多少對(duì)測(cè)試結(jié)果影響不大。

結(jié)論：多重光散射技術(shù)是一種非常可靠的表征蛋白質(zhì)失穩(wěn)過(guò)程的儀器，采用靜態(tài)多重光散射技術(shù)的Turbiscan適合測(cè)量蛋白在原位狀態(tài)下的粒徑/微觀結(jié)構(gòu)變化過(guò)程；采用動(dòng)態(tài)多重光散射技術(shù)的Rheolaser Master和Rheolaser Crystal分別用于表征蛋白變質(zhì)過(guò)程中的粘彈性變化過(guò)程和蛋白熱穩(wěn)定性。

  結(jié)晶分析儀 Rheolaser Crystal  

Rheolaser Crystal用于研究樣品微觀結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變過(guò)程，儀器基于先進(jìn)的微流變學(xué)原理對(duì)樣品進(jìn)行熱力學(xué)分析，監(jiān)測(cè)所有物理現(xiàn)象：結(jié)晶、融化、多晶形態(tài)轉(zhuǎn)變等。Rheolaser Crystal與Rheolaser Master類似，同樣采用DWS多散斑擴(kuò)散光譜學(xué)。入射的激光被樣品中的顆粒散射，產(chǎn)生干涉，利用高速攝像機(jī)捕捉散斑圖像。散斑圖像變換的速度直接與顆粒的運(yùn)動(dòng)速度相關(guān)，顆粒運(yùn)動(dòng)越快，散斑變化速度越快。