EHA105(pSoup)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品信息：
組成 BC313-01
EHA105(pSoup) Chemically Competent Cell 20×100μl
pGs2 (100ng/μl) 1 支
儲存條件：-70℃保存，避免反復(fù)凍融。不適合在液氮中保存。
基因型：C58 (rifR ) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)（strep R）Succinamopine pSoup（tetR）
產(chǎn)品介紹：
農(nóng)桿菌EHA105(pSoup)菌株由EHA105菌株改造而來，為C58型背景，核基因中含有抗性篩選基因rif。此菌株攜帶一無自
身轉(zhuǎn)運功能的琥珀堿型Ti質(zhì)粒pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir 基因（vir 基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，
pEHA105(pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移）。一些缺失農(nóng)桿菌
復(fù)制相關(guān)元件（如pVS1的復(fù)制起點REP區(qū)或pVS1質(zhì)粒的STA區(qū)）的表達(dá)質(zhì)粒如pGreen、pGreenII-62SK和pGs2等不能在EHA105菌株中繁殖。pSoup輔助質(zhì)粒可以幫助這些不完整雙元表達(dá)質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中的復(fù)制。EHA105(pSoup)菌株具有四環(huán)素（Tet）抗性。
EHA105(pSoup)適用于水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。經(jīng)植物表達(dá)質(zhì)粒pGs2檢測，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)10 3 cfu/μg，-70℃保存12 個月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。
轉(zhuǎn)化方法：（采用凍融方法）
1. 取-70℃保存的EHA105(pSoup)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于冰水浴中融化；
2. 無菌條件下，向感受態(tài)細(xì)胞中加入100ng-1μg質(zhì)粒DNA（次使用，做一下預(yù)實驗，確定所加質(zhì)粒的量），輕輕
混勻，冰水浴中靜置5 分鐘；
3. 將離心管置于液氮中速凍5分鐘；（注：可用干冰和無水乙醇混合物代替液氮）
4. 然后快速將離心管置于37℃水浴中保持5分鐘，不要晃動水面；
5. 將離心管放回冰水浴中，冰浴5分鐘；
6. 無菌條件下加入800μl無抗生素的2xYT、SOB、SOC或LB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2-3小時，菌體復(fù)蘇；
7. 6000rpm離心1分鐘收菌，留100μl左右上清，輕輕吹打重懸菌體，取適量菌液，涂布于相應(yīng)抗生素的LB平板上，于28℃培養(yǎng)
箱中倒置培養(yǎng)48-72小時。（實驗表明當(dāng)平板只含有50μg/ml的Kan時，28℃培養(yǎng)48 h即可看到菌落；平板中含有50 μg/ml Kan
和20 μg/ml Rif 時，需28℃培養(yǎng)60 h可看到菌落； 如果平板中含有50 μg/ml Kan和50 μg/ml Rif時則需要28℃培養(yǎng)72-90 h可看
到菌落）。
注意事項：
1. 加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化
效率下降一個數(shù)量級。
2. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。
4. 濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過高的濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。
5. 培養(yǎng)基中加入的目的是防止雜菌生長和篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti 質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti 質(zhì)粒丟失，
但Ti 質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮這些抗生素，Ti 質(zhì)粒丟失的概率極低(可以
忽略)。
6. 相關(guān)抗生素配制及工作濃度
（Rif）用DMSO配制成20mg/ml的儲存液，工作濃度為20μg/ml。（Tet）用甲醇溶解成10mg/ml的儲存液，
工作濃度為10μg/ml。硫酸（Kan）、（Strep）、硫酸（Gent）和羧芐鈉鹽（Carb）分別
用雙蒸水配制成濃度為50mg/ml，50mg/ml、40mg/ml和50mg/ml的儲存液，并用0.22μg濾器過濾除菌。工作濃度分別為
Kan:50μg/ml，Strep:50μg/ml，Gent:40μg/ml和Carb:50μg/ml。


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