LBA4404 農桿菌電轉感受態(tài)細胞

產品組成：

組成 BC305-01
LBA4404 Electrocompetent cells 20×50μl
pCAMBIA2301 ( 10ng/μl) 1 支
儲存條件：-70℃保存，避免反復凍融。
基因型：Ach5 (Rif R ) Ti pAL4404 (StrR ), Octopine type
產品說明：
LBA4404菌株為農桿菌Ach5型背景(Hoekema et al., 1983)，核基因中含有抗性基因(Rif)。此菌株還攜
帶一種自身轉運功能喪失的質粒(disarmed Ti plasmid)，LBA4404菌株含有章魚堿型Ti質粒pAL4404，該質粒含
有vir基因（
vir基因是TDNA插入植物基因組所必需的元件，pAL4404質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可
輔助植物雙元表達載體的T-DNA的轉移）。pAL4404質粒含有抗性(Str)，賦予LBA4404菌株抗性。
LBA4404農桿菌適用于番茄、煙草等植物的轉基因操作。LBA4404電轉感受態(tài)特別適用大質粒的轉化，經
pCAMBIA2301質粒檢測轉化效率大于10 5 cfu/μg DNA。
操作方法：
1. 電極間距為0.1cm的電轉杯（Gene Pulser®/MicroPulser™ electroporation cuvettes）插入碎冰中，壓實冰
面，冰中靜置5分鐘，使電轉杯充分降溫。（電轉杯重復使用方法：每次用完后，用大量的自來水沖洗
干凈去掉菌液和DNA，用蒸餾水洗3遍，將其泡在75%乙醇中30分鐘，取出杯子，瀝干液體，放在超凈
臺中，使乙醇充分揮發(fā)，蓋上蓋子放干燥地方備用）
2. 取-70℃保存的農桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入10ng-1μg質粒DNA（洗脫或溶解質粒的
溶液中離子不能太高，可用雙蒸水稀釋：次使用前做預實驗確定所加質粒的量），用手
管底混勻，立即插入冰中，在超凈臺中用無菌吸頭將感受態(tài)-質粒混合物快速移到電擊杯中，蓋上
杯蓋，空管保留待用。
3. 啟動電轉儀，設置電擊參數(shù)：C=25μF，PC=200ohm，V=2.4KV（此參數(shù)為BioRad公司推薦，依據(jù)不同
電轉儀設置針對農桿菌合適的電擊參數(shù)）。用紙巾擦掉電轉杯外部的水分，將電轉杯快速放入電轉槽
中進行電擊步驟。電擊完成后，將電轉杯快速插入冰中，加入700μl無抗生素的LB并轉移到原來保留
的感受態(tài)空管中，28℃，150-200rpm，振蕩培養(yǎng)2-3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取200μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊，取100μl的菌液涂布于含相應抗生素
的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48小時
即可；平板中同時加入50 μg/mlKan，20μg/mlRif時，需28℃培養(yǎng)60小時；如果使用的平板含有50μg/mlRif
則需要28℃培養(yǎng)72-90小時）。
注意事項：
1. 混入質粒時應輕柔操作，加入質粒的體積不應大于感受態(tài)體積的1/10，質粒不純或超大質粒會導致轉化
效率急劇下降。
2. 平板上菌落過多時，菌落很小。為了獲得大的菌落，應減少質粒用量或減少涂布量，或將菌落轉移到
新平板上生長。
3. 使用的工作濃度濃度不應高于25 μg/ml，過高的濃度會降低生長速度和轉化效率。
4. 具有防止雜菌生長篩選農桿菌的作用；根據(jù)所用菌株抗性加入或可防止Ti質
粒丟失，但不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養(yǎng)農桿菌時可不考慮添加或，
Ti質粒丟失的概率極低 (可忽略)。
Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA (1983) Binary vector strategy based on separation of
vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid.Nature 303:179-180


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