K562 feeder cell  殘留檢測(cè)試劑盒說明書

貨號(hào)： HG-KF001

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

基因編輯的K562 細(xì)胞因其良好的促進(jìn)增殖作用而被廣泛研究和使用。研究表明使用基因編輯的K562 細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞能使NK細(xì)胞的擴(kuò)增效率提高幾十到上萬倍。在最近的FDA發(fā)布的指南文件《Considerations for the Use of Human- and AnimalDerived Materials in the Manufacture of Cellular and Gene Therapy and Tissue-Engineered Medical Products》和藥監(jiān)局發(fā)布的《淺析細(xì)胞治療產(chǎn)品中滋養(yǎng)細(xì)胞的使用及控制策略》指南文件中，均提及可以使用經(jīng)過輻照后的K562細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞，用于體外培養(yǎng)使用。
盡管K562細(xì)胞經(jīng)過輻照處理，且易被生長(zhǎng)的NK 細(xì)胞殺死，但仍需確保細(xì)胞終產(chǎn)品中盡可能沒有滋養(yǎng)細(xì)胞殘留，以保障患者安全。建議研究人員開發(fā)靈敏度高的檢測(cè)方法，例如反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測(cè)法、微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（ddPCR）檢測(cè)法等，并對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行專屬性、準(zhǔn)確性、精密度、檢測(cè)限等驗(yàn)證，以保證檢測(cè)方法能對(duì)生產(chǎn)過程及終產(chǎn)品進(jìn)行有效表征，減少對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量、臨床療效及安全性的影響。
本試劑盒使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測(cè)法，設(shè)計(jì)特異性的靶標(biāo)位點(diǎn)，進(jìn)行K562 feeder cell 殘留檢測(cè)。
本試劑盒的檢測(cè)范圍：10 copies/μL~ 1×10⁶ copies/μL，K562細(xì)胞的最i低檢測(cè)限度為0.05%。

應(yīng)用：

細(xì)胞制劑樣本中K562 feeder cell殘留檢測(cè)。

規(guī)格：

100 Reactions

產(chǎn)品組成：

存儲(chǔ)條件及有效期

-18℃及以下儲(chǔ)存，有效期 18 個(gè)月

適用機(jī)型（包括但不限于）

◆?ABI PRISM 7500 

 ◆?FQD-96A（博日） 

 ◆?CFX96(Bio-Rad) 

 ◆?Roche Light Cycler 480

• 需自行準(zhǔn)備的材料

(1) 熒光定量PCR儀器（包括FAM和VIC熒光通道）

(2) 渦旋振蕩器

(3) 掌上離心機(jī)

(4) RNA 提取試劑     

(5) 逆轉(zhuǎn)錄檢測(cè)試劑

(6) 移液器及吸頭     

(7) 八聯(lián)排管加蓋或96孔半裙邊板加封口膜

實(shí)驗(yàn)步驟

1.?RNA 提取

取一定量的細(xì)胞懸液（1E6-5E6細(xì)胞）進(jìn)行RNA提取

2.?逆轉(zhuǎn)錄

對(duì)提取的細(xì)胞RNA進(jìn)行基因組DNA去除和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得檢測(cè)使用的cDNA。

3.?PCR 擴(kuò)增

3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：

取出定量標(biāo)準(zhǔn)品和DNA稀釋液，置于4℃冰箱中融化；待融化完i全后，上下顛倒混勻20次后，在復(fù)合轉(zhuǎn)子離心機(jī)中6000 rpm 離心5秒，用DNA 稀釋液將RNA定量標(biāo)準(zhǔn)品(1E+08 copies/μL)梯度稀釋至1E+06 copies/μL、1E+05 copies/μL、1E+04 copies/μL、1E+03 copies/μL，1E+02 copies/μL，10 copies/μL。具體操作如下：取 7 支 1.5 mL 離心管，分別標(biāo)記為STD0，STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6，參考下表進(jìn)行稀釋操作（每一步稀釋都需充分震蕩混勻）：

3.2 PCR反應(yīng)液配置
根據(jù)樣本檢測(cè)數(shù)量計(jì)算需要的反應(yīng)孔數(shù)，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)。備注：根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的Mix混合液總量：Mix混合液 =（反應(yīng)孔數(shù)+2）× 15 μL（含有2孔的損失量）。在生物安全柜內(nèi)配制PCR混合液，配置情況如表所示：

備注：如果儀器不需要加ROX，可以將50x ROX 替換為無酶水。
各個(gè)反應(yīng)孔加樣情況如表所示：

3.3 加完樣后，將8聯(lián)排蓋子蓋上，先蓋上兩頭的蓋子，再蓋上中間的蓋子，并在蓋子邊 緣做好標(biāo)記。
3.4 加樣完成密封好管子后，先在復(fù)合轉(zhuǎn)子離心機(jī)中6000 rpm離心10秒將管壁的液體離心收集至管底，再置于調(diào)節(jié)至6檔的旋渦混合器上震蕩10秒以上，完i全混勻反應(yīng)液，再在復(fù)合轉(zhuǎn)子離心機(jī)中6000 rpm離心10秒將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。
3.5 PCR程序設(shè)置
打開PCR儀，設(shè)置PCR反應(yīng)程序：

3.6 設(shè)置樣品反應(yīng)板：按照PCR反應(yīng)液加樣位置編輯標(biāo)準(zhǔn)品、NTC、Neg、ERC、待測(cè)樣本的信息。在反應(yīng)板圖表中，選擇樣品孔，在Sample Type中下拉選擇Unknow，勾選熒光FAM，Target Name命名為K562，勾選熒光VIC，Target Name命名ABL，輸入每個(gè)樣品的重復(fù)次數(shù)及Sample Name。輸入每個(gè)稀釋梯度的重復(fù)次數(shù)及Sample Name。并且分別在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6的Concentration一欄賦值為1E+06、1E+05、1E+04、1E+03、1E+02、1E+01，選擇單位（copies/μL）。
3.7 開啟加熱蓋，按照樣品板編輯信息放置八聯(lián)管，關(guān)閉加熱蓋，啟動(dòng)PCR運(yùn)行程序，開始PCR反應(yīng)。

4.?數(shù)據(jù)處理

4.1 反應(yīng)結(jié)束后，儀器會(huì)自動(dòng)設(shè)置基線和閾值。保存并導(dǎo)出結(jié)果。
4.2 利用excel計(jì)算結(jié)果:將儀器直接導(dǎo)出的檢測(cè)結(jié)果帶入預(yù)先設(shè)計(jì)好的檢測(cè)結(jié)果分析表格中，進(jìn)行最終的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算，并將計(jì)算的excel表格附件到檢測(cè)記錄中。
4.3 計(jì)算公式K562 feeder cell 殘留比例 =K562 檢測(cè)結(jié)果/ABL 檢測(cè)結(jié)果*100%

5.?系統(tǒng)適用性判定

5.1 三個(gè)平行孔間的Ct值變異系數(shù)CV%≤5%，Ct值大于35的孔除外。
5.2 空白 NTC 應(yīng)無Ct值或大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最i低濃度2個(gè)Ct值。
5.3 PCR 反應(yīng)擴(kuò)增效率Effective：85.0%~110.0%，R2≥0.990。

6.?符號(hào)及縮寫

6.1 標(biāo)準(zhǔn)品(Standard Products)：STD；
6.2 無模板對(duì)照：NTC；
6.3 供試品（Sample）：S。

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗(yàn)證，無需分裝。
2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測(cè)樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域，不可在一個(gè)區(qū)域內(nèi)操作，配制人員需穿戴整齊，戴 好口罩、手套和穿好潔凈服。
3. 注意在不同加樣步驟間及時(shí)更換吸頭，避免交叉污染，避免長(zhǎng)時(shí)開蓋。
4. 試劑盒必須在有效期內(nèi)使用。
5. 試劑盒內(nèi)所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用。
6. 只有嚴(yán)格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證最佳檢測(cè)效果。
7. 盡量在當(dāng)天完成樣本前處理純化后立即進(jìn)行后續(xù) qPCR 檢測(cè)，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
8. 最終的試驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)。
9. 公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量， 預(yù)留充足的樣本。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。

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效期保障：嚴(yán)格把控產(chǎn)品質(zhì)量，確保試劑效期新鮮，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

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